Page 52 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第8期
               ·1086 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年8月


              染、静脉血栓栓塞和急性肾损伤。由于病因异质                             空载体pENTER、引物合成（南京擎科生物科技有限
              性，目前儿童NS没有一种万全的治疗方法。虽然特                           公司）；DMEM培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清、
              发性 NS患儿通过治疗病情可获得高度缓解，但接受                          LB 肉汤（Sigma 公司，美国）；青链霉素双抗、SDS⁃
              肾活检的激素抵抗型肾病综合征（steroid⁃resistant ne⁃              PAGE 凝胶配制试剂盒、Western blot 一抗稀释液、
              phrotic syndrome，SRNS）患儿中有 12%~15%对免疫             Western blot二抗稀释液、染色质免疫沉淀检测试剂
              抑制治疗无反应，其中约50%将进展为终末期肾病                           盒（ChIP Assay Kit）（上海碧云天）；去内毒素小量质
             （end stage renal disease，ESRD） 。因此，非常需要            粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒（Omega公司，美国）；
                                          ［2］
              阐明 NS 进展的潜在分子机制，并为 NS 的治疗开辟                       逆转录酶、SYBR Green qPCR Master Mix（TaKaRa 公
              新的道路。                                             司，日本）；质粒转染试剂Lipofectamine 3000脂质体
                  生长抑制特异性基因6（growth arrest specific 6，          （Invitrogen 公司，美国）；双萤光素酶报告基因检测

              Gas6）编码一种维生素 K 依赖的分泌型蛋白。Gas6                      试剂盒（Promega 公司，美国）；琼脂糖粉（Biowest 公
              蛋白是一种与受体酪氨酸激酶Tyro3、Axl和Mer 结合                     司，西班牙）；总蛋白提取试剂盒（南京凯基）；
              的细胞因子。大量研究表明Gas6与Axl相互作用可                         TFAP2A 一抗（Abcam 公司，美国）；辣根过氧化物酶
              促进癌症进展 。Gas6还可促进毛囊干细胞生长 ，                         标记羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗、
                                                         ［4］
                          ［3］
                                      ［5］
              增强非小细胞肺癌的增殖 。通过与 TAM（Tyro3⁃                       Gas6、NPHS2、NPHS1、GAPDH 一 抗（Proteintech 公
              Axl⁃Mer）受体相互作用激活下游信号通路（如                          司，中国）；Bax、BCL⁃2 一抗（上海 Abmart 公司）；
              PLCγ、PI3K、ERK和NF⁃κB）来调节细胞存活、增殖、                   DNA Marker（TaKaRa 公 司 ，日 本）；蛋 白 Marker
                                   ［6］
              迁移、分化、黏附和凋亡 。Gas6在IgA肾病和狼疮                        （Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；全 DNA 提取
              性肾炎患者的肾脏中的表达比在健康者中明显增                             试剂盒（北京天根生化）；GelRed 核酸染料（南京
              多，且Gas6激活Axl受体可促进肾小球损伤                ［7-9］ ，而肾   诺唯赞）；LB 培养板粉（Boykyo 公司，日本）；Gas6
              小球损伤可以导致NS。                                       细 胞 因 子（MCE 公 司 ，美 国）；流 式 细 胞 仪（BD
                  目前对Gas6的研究主要集中在其与下游信号通                        Biosciences 公 司 ，美 国）；紫 外 光 栅 分 光 光 度 计
              路的相互作用上，对于Gas6自身的转录调控机制研                          （Eppendorf 公 司 ，德 国）；TD 20/20n single tube
              究较少。本研究通过构建阿霉素肾病细胞模型来探                            luminometer（武汉盖尔德纳科技有限公司）。
              究Gas6与NS的相关关系，通过Gas6细胞因子直接作                       1.2  方法
              用于HEK⁃293T细胞来探究Gas6对HEK⁃293T细胞                    1.2.1 生信分析
              凋亡的影响，通过构建人Gas6启动子萤光素酶报告                               用 GEO 数 据 库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/
              质粒，并将其转染至HEK⁃293T细胞，分析Gas6启动                      gds/和 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/）预测
              子的萤光素酶活性，同时敲低和过表达转录因子                             NS 病理表型之一的肾小球硬化的高表达及低表达
              AP⁃2a（transcription factor AP⁃2 alpha，TFAP2A），应用  基因聚类分析结果；用 JASPAR 数据库（https：//jas⁃
              双萤光素酶基因报告系统、qRT⁃PCR和蛋白质免疫印                        par.genereg.net/）和 PROMO 数据库（http：//alggen.lsi.
              迹实验分别检测Gas6启动子活性、mRNA表达量、蛋                        upc.es/cgi ⁃ bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=
              白表达量是否改变。本研究首次探索Gas6对NS的                          TF_8.3/）预测 Gas6 启动子的转录因子结合位点；用
              影响，为阐明NS的分子机制奠定了一定基础，同时为                          GEPIA 数 据 库（http：//gepia.cancer ⁃ pku.cn/）预 测
              进一步研究人Gas6基因的转录调控机制奠定基础。                          Gas6 和 TFAP2A 在肾皮质中的相关关系。
                                                                1.2.2 细胞培养
              1  材料和方法
                                                                     HEK⁃293T 细胞和 MPC5 细胞在含有 10%胎牛
              1.1 材料                                            血清和1%青链霉素双抗的DMEM 高糖培养基中培
                  人 肧 肾 细 胞（HEK ⁃ 293T）、小 鼠 肾 足 细 胞             养，并置于37 ℃、5%CO2培养箱，2~3 d传代1次。实

             （MPC5）、pRL⁃TK（海肾萤光素酶报告质粒）、pGL3⁃                    验操作均采用对数期生长细胞。
              basic质粒为本实验室保存；Gas6基因启动子萤光素                       1.2.3 流式细胞术

              酶报告质粒 pGas6⁃1450、结合位点突变质粒 pGas6⁃                       流式细胞术检测经 Gas6 细胞因子刺激 24 h 后
              1450 mut、TFAP2A 小干扰 RNA siTFAP2A 及其阴性             的HEK⁃293T细胞的凋亡百分率。分别用等体积生
              对照siNC、TFAP2A过表达质粒pENTER⁃TFAP2A及                  理盐水、10 ng/mL Gas6细胞因子、100 ng/mL Gas6细
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