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第43卷第8期                 颜 凤，周国平. 转录因子AP2A对肾病相关基因Gas6的调控研究［J］.
                  2023年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1085-1093                      ·1087 ·


                胞因子刺激 HEK⁃293T 细胞 24 h，用 PBS 洗涤细胞                 1.2.5  人Gas6启动子及转录因子结合位点突变的启
                2 次，收集细胞，用 100 μL 1×Binding Buffer 重悬，加           动子的萤光素酶报告基因重组质粒的构建与鉴定
                入 Annexin V⁃FITC 和 PI staining solution 各 2.5 μL，     人 Gas6 基因（GenBank 编号：NC_000013.11）序
                混匀，室温避光孵育 10 min，加入 300 μL 1×Binding              列从美国国立生物技术中心数据库 NCBI（https：//
                Buffer，混匀，使用流式细胞仪检测。                              www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）找 到 起 始 密 码 子 上 游
                1.2.4 染色质免疫沉淀（ChIP）                               1 400 bp片段、下游50 bp片段序列。将人Gas6启动
                    使用ChIP Assay Kit试剂盒，根据其说明书进行                  子的转录起始位点（TSS）设置为+1。将人Gas6启动
                实验及分析。将 HEK⁃293T 细胞在 1%甲醛中固定                      子片段-1 400~+50 nt 的序列插入 pGL3⁃Basic 载体

                10 min，沉淀细胞并充分裂解，超声剪切基因组DNA                       中，命名为 pGas6⁃1450 并测序，使用 NCBI 的 blast
                使其断裂成 200~1 000 bp 大小（去除交联，纯化                    （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能鉴定该
                DNA，进行琼脂糖凝胶电泳观察超声处理效果）。                           质粒的正确性。以pGas6⁃1450 为模板构建TFAP2A
                样品特异性免疫沉淀后去除交联并纯化，选择引物                            结合位点突变的启动子质粒，分别命名为 pGas6⁃
                进行PCR或qRT⁃PCR并进行琼脂糖凝胶电泳（目的                        1450 mut1、pGas6⁃1450 mut2、pGas6⁃1450 mut1+2

                PCR 产 物 碱 基 编 号 ：- 418~- 283，上 游 引 物 ：5′ ⁃       （下文合称为pGas6⁃1450 mut）并测序核对。具体突
                AAACCGTCGCATTTCACTCG ⁃ 3′ ，下 游 引 物 ：5′ ⁃          变点见图1。
                CCCCGAATCTACTGCATCCT⁃3′；Control Primers：上         1.2.6 双萤光素酶报告基因实验
                游引物：5′⁃TACTAGCGGTTTTACGGGCG⁃3′，下游引                    将HEK⁃293T细胞接种到96孔板中（1×10 个/孔）。
                                                                                                         4
                物：5′⁃TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA⁃3′）。                24 h 后，将 100 ng pGas6⁃1450 或 pGas6⁃1450 mut 或


                                        原始序列⁃397 5′⁃TGGCCCCCAGTGGG……CAACCACCGCCTG⁃3′ -152
                                        突变序列⁃397 5′⁃TGGTCCCCAGTGGG……CAACCACCGTCTG⁃3′ -152
                                                      mut1                   mut2
                                                          图1   突变序列
                                                   Figure 1  The mutated sequences


                pGL3⁃basic 质粒与 4 ng pRL⁃TK 质粒共同转染到细                             表1   小干扰RNA序列
                胞中，24 h 后检测 pGas6⁃1450 或 pGas6⁃1450 mut 的                     Table 1 Sequences of siRNA
                                                                     siRNA                 序列（5′→3′）
                启动子活性；将 100 ng pGas6⁃1450 或 pGas6⁃1450
                mut 和 siTFAP2A（50 nmol/L）或 siNC（50 nmol/L）与        siTFAP2A     正义链：CCUGCUCACAUCACUAGUATT
                                                                                反义链：UACUAGUGAUGUGAGCAGGTT
                4 ng pRL⁃TK质粒共同转染到细胞中，24 h后检测敲
                                                                   siNC         正义链：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
                低TFAP2A对pGas6⁃1450或pGas6⁃1450 mut启动子
                                                                                反义链：ACGUGACACGUUCGGAGAATT
                活性的影响；同时，将 100 ng pGas6⁃1450 或 pGas6⁃
                1450 mut 和 100 ng pENTER⁃TFAP2A 或 pENTER 与        ADR）（0.2 μg/mL）或等体积生理盐水（normal sa⁃
                4 ng pRL⁃TK质粒共同转染到细胞中，24 h后检测过                    line，NS）刺激MPC5细胞，检测肾病相关指标mRNA
                表达TFAP2A对pGas6⁃1450或pGas6⁃1450 mut启动              表达量的变化以确定阿霉素细胞模型构建成功与
                子活性的影响。检测方法采用双萤光素酶报告基                             否，同时检测 Gas6 mRNA 表达量的变化；用 Gas6 细
                因系统，使用 TD 20/20 荧光光度计，按照双萤光素                      胞因子（100 ng/mL）或等体积 NS 刺激 MPC5 细胞后

                酶检测试剂盒步骤分别检测 pGL3⁃basic、pGas6⁃                    检测肾病相关指标表达量的变化；用Gas6细胞因子
                1450、pGas6⁃1450 mut 以及敲低和过表达 TFAP2A              （100 ng/mL）刺激HEK⁃293T细胞检测凋亡相关指标
                后 pGas6⁃1450 和 pGas6⁃1450 mut 的启动子活性，并            表达量的变化；将小干扰RNA或过表达质粒或相应
                将其标准化为pRL⁃TK的活性。结果至少重复3次。                         的对照试剂转染到HEK⁃293T细胞中检测敲低或过
                具体小干扰RNA序列见表1。                                    表达TFAP2A对Gas6 mRNA表达量的影响。24 h后
                1.2.7 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）                          使用 Omega RNA 提取试剂盒从细胞系中提取总
                    将MPC5细胞或HEK⁃293T细胞接种到12孔板                     RNA，并将其逆转录为第 1 链 cDNA，进行 qRT⁃PCR
                中（1×10 个/孔）。24 h 后用阿霉素（adriamycin，                实验。反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃
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