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第43卷第9期       邓   惠，陈格格，徐 莉，等. 4⁃羟基水杨酰苯胺对T淋巴细胞白血病肿瘤增殖与凋亡的影响［J］.
                  2023年9月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（9）：1185-1193                      ·1187 ·


                染液1 mL，室温避光染色1 h后吸走残余染液，拍照                        防荧光淬灭剂封片后，激光扫描共聚焦显微镜观察
                并计算克隆形成数。                                         γ⁃H2AX阳性细胞，并拍照。
                1.2.4 细胞周期检测                                      1.2.8 裸鼠移植瘤与HDS的抗肿瘤活性检测
                    收集对数生长期的 Jurkat 和 Hut⁃78 细胞，配成                    收集对数生长期的 Jurkat 细胞，无菌 PBS 清洗
                                                                                            7
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                密度为2×10 ~3×10 个/mL的细胞悬液，按每孔1 mL
                接种至 24 孔板中，用不同浓度的 HDS 药物处理，放                      基质胶按体积比1∶1混匀置于冰上备用。裸鼠注射
                入培养箱培养；至处理时间点时收集细胞至流式管                            部位消毒后，用 1 mL 注射器抽取细胞悬液，皮下注
                中，按照“先慢后快”的原则，逐滴向每管加入 1 mL                        射 100 μL，定期观察裸鼠情况。待移植瘤长至约
                预冷（-20 ℃）的 70%乙醇，-20 ℃固定至少 12 h，检                 0.5 cm×0.5 cm时，将裸鼠随机分为对照组和HDS处
                测当天离心并用 PBS 清洗 1 遍后，每管加 300 μL 的                  理组。HDS处理组腹腔注射HDS 100 mg/（kg·d），对

                细胞周期检测试剂 PI/RNase，室温避光孵育 30 min                   照组注射同体积的溶剂DMSO。每日记录裸鼠移植
                后，用流式细胞仪检测。                                       瘤的大小，至实验结束，裸鼠安乐死后，剥离皮下肿
                1.2.5 细胞凋亡检测                                      瘤组织，并收集裸鼠心脏、肝脏和肾脏组织，在 4%
                    收集对数生长期的 Jurkat 和 Hut⁃78 细胞，配成                多聚甲醛中固定备用。
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                密度为2×10 ~3×10 个/mL的细胞悬液，按每孔1 mL                   1.3  统计学方法
                接种至24孔板中，每孔按不同浓度加入HDS药物处                              采用SPSS 20.0进行统计分析。数据以均数±标
                理，放入培养箱培养；至处理时间点时收集细胞至流                           准差（x ± s）表示；实验组与对照组间比较采用 Stu⁃
                式管中，每管加入 2.5 μL Annexin⁃V⁃FITC 和 50 μL            dent’s t 检验；多组比较采用单因素方差分析（one⁃
                1× Binding Buffer，室温避光染色 15 min；每管加入              way ANOVA），各组之间的两两比较采用 SNK 法。
                5 μL PI 和 250 μL 1× Binding Buffer，室温避光染色         P < 0.05为差异有统计学意义。
                5 min 后，用流式细胞仪检测。读取数据，计算细胞
                                                                  2  结 果
                凋亡百分比。
                1.2.6 Western blot检测                              2.1  HDS 可抑制 T 淋巴细胞白血病细胞的增殖和
                    收集对数生长期的 Jurkat 和 Hut⁃78 细胞，配成                克隆形成
                密度为2×10 ~3×10 个/mL的细胞悬液，按不同浓度                         HDS 是一种临床批准的药物，其相对分子量为
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                加入 HDS 药物处理 48 h 后，用 RIPA 蛋白裂解液提                  229.24 Da（图 1A）。为了确定 HDS 是否具有抗 T 淋
                取细胞总蛋白并进行蛋白定量，加入 SDS⁃PAGE 蛋                       巴细胞白血病肿瘤的能力，将不同浓度的 HDS（0、
                白上样缓冲液，取 20 μL 蛋白进行 SDS⁃PAGE 电泳                   25、50、75、100、150、200、300、400 μmol/L）分别作用
                后转移于硝化纤维素（NC）微孔滤膜，5% BSA 封闭                       于 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat 和 Hut⁃78 细胞
                1 h 后进行抗体孵育（4 ℃冰箱过夜）。次日用 PBST                     24、48、72 h。HDS对T淋巴细胞白血病细胞株有细
                清洗 NC 膜 3 遍以后，根据一抗种属进行二抗孵育                        胞毒性，且表现出剂量和时间依赖性（图 1B、C）。
               （室温，1 h），再用PBST清洗3遍。Amersham Imager                HDS作用48 h后，Jurkat和Hut⁃78细胞半数抑制浓度
                600 自动化学发光凝胶成像仪曝光检测并保存图                          （IC50 值）分 别 为 151.18 μmol/L 和 173.67 μmol/L。
                片，用Image J软件对图片进行分析。                              琼脂集落形成法检测不同浓度的 HDS 对 Jurkat 和
                1.2.7 γ⁃H2AX免疫荧光法                                 Hut⁃78 细胞集落形成能力的影响。结果显示，HDS
                    收集对数生长期的 Jurkat 和 Hut⁃78 细胞，配成                可显著抑制两种细胞系的集落形成，且集落形成数
                密度为2×10 ~3×10 个/mL的细胞悬液，按不同浓度                     与药物浓度呈负相关（图1D、E）。
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                加入HDS药物处理48 h后，用PBS清洗1次，按细胞                       2.2  HDS 可诱导 T 淋巴细胞白血病细胞停滞于细
                沉淀∶PBS=1∶20（体积比）的比例加入适量PBS重悬                      胞周期S期
                细胞，混匀后每个样品取 50 μL 均匀涂片于正电荷                            为探讨HDS对T淋巴细胞白血病细胞细胞周期
                黏附防脱载玻片上（涂片面积约为 1 cm×1 cm），经                      的影响，用不同浓度的 HDS 作用于 Jurkat 和 Hut⁃78

                4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X⁃100 破膜、0.5%                细胞（0、100、300 μmol/L）48 h，然后用碘化丙啶（PI）
                BSA 封闭、一抗γ⁃H2AX 抗体孵育（4 ℃冰箱过夜）、                    染色和流式细胞术分析细胞周期。结果显示，处于
                R488标记的二抗孵育（室温，1 h）、DAPI孵育10 min、                 S期的Jurkat（图2A）和Hut⁃78（图2B）细胞群比例逐
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