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第44卷第10期           杨雨欣，刘晨阳，金琳羚，等. 利拉鲁肽对二氧化硅诱导巨噬细胞极化的影响及机制［J］.
                 2024年10月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（10）：1353-1361                      ·1355 ·


                院上海细胞库），Li、佛波酯（phorbol⁃12⁃myristate⁃13⁃           光二抗（1∶1 000），37 ℃孵育 1 h，PBST 洗涤 3 次，
                acetate，PMA）、SiO2 （Sigma 公司，美国），RPMI 1640         每孔加入DAPI反应液300 μL，室温避光孵育10 min
                培养基（Gibco 公司，美国），细胞计数试剂盒（cell                     后，PBST清洗3次，滴加适量抗荧光猝灭液封片，将
                counting kit，CCK）⁃8（杭州联科生物科技有限公司），                爬片置于荧光显微镜下，观察荧光强度并拍照。
                白细胞介素（interleukin，IL）⁃1β ELISA 检测试剂盒              1.2.4 CCK⁃8法检测巨噬细胞活性
               （上海恒远生物科技有限公司）、转化生长因子                                  将对数期THP⁃1细胞以5×10 个/孔接种于96孔
                                                                                                3
               （transforming growth factor，TGF）⁃β1 ELISA 检测试      板，PMA（150 ng/mL）诱导分化48 h后，弃上清，更换为
                剂盒（武汉华美生物工程有限公司），增强型线粒体                           含0、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L Li的RPMI 1640
                膜电位检测试剂盒（JC⁃1）（上海碧云天生物技术公                         完全培养基处理细胞24 h，弃培养基，PBS清洗3次，
                司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂           每孔加入100 μL CCK⁃8工作液，孵育2 h，采用全自

                盒（南京建成生物工程研究所），CD68 抗体（Abcam                      动酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度值。按照公
                公司，美国），荧光染料 Alexa Fluor 488 标记山羊抗                 式细胞活力（%）=［（实验孔吸光度值-空白孔吸光度
                小鼠IgG（上海碧云天生物技术公司）NOD样受体蛋                         值）/（对照孔吸光度值-空白孔吸光度值）］×100%，

                白 3（NOD⁃like receptor protein 3，NLRP3）抗体（No⁃      计算细胞活力。
                vus 公司，美国）；半胱天冬蛋白酶⁃1（cysteinyl aspar⁃             1.2.5  ELISA 法检测细胞培养上清中 IL⁃1β、IL⁃10
                tate specific proteinase，Caspase⁃1）p20 抗体、精氨酸     及TGF⁃β1
                酶（arginase，Arg）⁃1 抗体、IL⁃10 ELISA 检测试剂盒                收集各组细胞培养上清于 4 ℃、1 000 g 离心
               （武汉三鹰生物技术有限公司）。                                    20 min 去除杂质及细胞碎片。除空白孔外，分别将
                1.2  方法                                           各组细胞培养上清及不同浓度标准品加入相应孔
                1.2.1 SiO2的制备                                     中（100 μL/孔），用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱
                    称取适量SiO2混匀于0.9%生理盐水中，配制成                      中孵育 90 min。洗板 4 次，除空白孔外，每孔加入
                浓度为10 mg/mL的储备液，超声30 min，200 ℃灭菌                  100 μL生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应
                90 min 后，4 ℃保存备用。实验时，用 RPMI1640培                  孔，37 ℃孵箱中孵育 60 min。洗板 4 次，除空白孔
                养基稀释为工作液。                                         外，每孔加入100 μL酶结合物工作液，用封板胶纸封
                1.2.2 巨噬细胞培养、诱导分化及分组                              住反应孔，37 ℃孵箱中孵育30 min。洗板4次，每孔
                    THP⁃1细胞用含10 %胎牛血清的RPMI 1640完                  加入 100 μL 显色剂，避光 37 ℃孵箱中孵育 15 min。
                全培养基培养于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱。取状                       每孔加入 100 μ L 终止液，混匀后在酶标仪上读取
                态良好的THP⁃1细胞，加入150 ng/mL PMA诱导48 h，                450 nm处的吸光度值。
                细胞诱导贴壁为巨噬细胞。弃培养基，PBS 洗涤后                          1.2.6  Western blot 测定 NLRP3、Caspsae⁃1 p20 及
                用于后续实验。                                           Arg⁃1表达水平
                                                                      各组去除细胞培养液，加入细胞裂解液（含蛋
                    细胞分为5组，分别为对照（Control）组、SiO2组（SiO2
                浓度为 50 μg/cm ）及 SiO2+Li（10、100、1 000 nmol/L）      白酶抑制剂）提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓
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                组。SiO2+Li组中先使用Li预处理1 h，再使用 SiO2刺                  度。各组细胞总蛋白使用浓度为 7.5%~12.5%的
                激24 h。                                            SDS⁃PAGE 胶分离后转移到 PVDF 膜上，5%脱脂奶
                1.2.3 免疫荧光法检测CD68表达                               粉溶液室温封闭 1 h，加入 NLRP3 抗体（1∶1 000）、
                    取对数生长期THP⁃1细胞，制成8×10 个/mL的                    Caspsae⁃1 p20抗体（1∶1 000）、Arg⁃1抗体（1∶1 000），
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                细胞悬液，接种于装有爬片的 24 孔细胞培养板中，                         4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入二抗，室温孵育
                每孔 500 μL 细胞悬液。加入 150 ng/mL PMA 诱导                1 h。TBST洗涤3次后加入ECL化学发光液，置于化

                48 h，细胞诱导贴壁为巨噬细胞。弃去培养基，PBS                        学发光仪中曝光并拍照，使用Image Lab软件分析灰
                洗涤3次，加入4%多聚甲醛，室温下固定20 min。弃                       度值。
                去多聚甲醛，PBS洗涤3次。0.1% Triton X⁃100室温破                1.2.7 JC⁃1荧光探针染色检测线粒体膜电位
                膜后，PBS洗涤3次。使用5% BSA室温封闭30 min，                        将各组细胞接种于 6 孔板中，吸除培养液，PBS

                去除BSA，向24孔板中加入CD68抗体（1∶1 000），4 ℃                 洗涤1次，加入1 mL细胞培养液。各孔中分别加入
                冰箱孵育过夜。次日使用1×PBST洗涤3次，加入荧                         1 mL JC⁃1染色工作液，充分混匀。37 ℃细胞培养箱
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