Page 48 - 南京医科大学自然版
P. 48

第44卷第10期
               ·1364 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年10月


              RNA，测 定 其 浓 度 和 纯 度 并 逆 转 录 为 cDNA，以              对 KG⁃1 细胞作用 48 h 后，其增殖抑制作用呈剂量
              GAPDH 作为内参，检测各组凋亡相关基因 Bcl⁃2、                      依赖性（图 1A、B）。绘制细胞增殖抑制曲线，计算
              Bax 及 Caspase⁃3 相对表达水平。目的基因相对表                    得到 ATO 及普纳替尼作用 48 h 的 IC50 值分别为
              达水平以 2    -ΔΔCT 表示，ΔΔCT =（CT 药物组目的基因-             8.204 μg/mL 和 30.99 nmol/L，以 1/2 的 IC50为实验浓
              CT药物组内参基因）-（CT对照组目的基因-CT对照                        度行后续实验。将两药联合作用KG⁃1细胞48 h后，
              组内参基因）。                                           其增殖抑制率较单药作用进一步增加，差异有统计

              1.2.4  Western blot检测凋亡相关蛋白、FGFR1蛋白               学意义（图1C）。
              及信号通路分子磷酸化水平                                      2.2  ATO、普纳替尼单药及联合用药对 KG⁃1 细胞
                  分别收集以上4组细胞，用含1 mmol/L PMSF的                   集落形成及凋亡的影响
              RIPA 裂解液裂解细胞，抽提细胞总蛋白，测定蛋白                              与 DMSO 组相比，ATO、普纳替尼作用于 KG⁃1
              浓度，每孔蛋白上样量为60 μg，用120 g/L的聚丙烯                     细胞后，集落形成减少，两药联合作用后，克隆形成

              酰胺凝胶电泳 2 h，湿转印至无水甲醇浸泡的 PVDF                       较单药作用进一步减少（图1D、E），差异均有统计学
              膜，50 g/L 脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h 后，加入相应                    意义；ATO、普纳替尼作用KG⁃1细胞 48 h后，细胞凋
              的一抗孵育，4 ℃过夜，用HRP标记的二抗室温孵育                         亡率分别为（11.00±1.50）%及（19.00±1.09）%，DMSO
              2 h，ECL 发光液显色，进行图像采集并用 Image J 分                  组细胞凋亡率为（1.40±0.11）%，差异有统计学意
              析软件进行灰度扫描分析。                                      义 。 两 药 联 合 作 用 后 ，凋 亡 率 进 一 步 增 加 ，为
              1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率                               （28.80±1.50）%，明显高于ATO 组和普纳替尼组（图
                  用 IMDM 培养基调整细胞密度为 5×10 个/mL，                  1F），差异有统计学意义。
                                                     5
              接种于6孔板，实验分组同前。置培养箱中培养48 h                         2.3  ATO、普纳替尼单药及联合用药对 KG⁃1 细胞
              后，收集待测细胞并用 PBS 洗 1 次，结合缓冲液洗                       凋亡相关基因的影响
              1次，用100μL结合缓冲液重悬。每管加入5μL Annexin                       KG⁃1 细胞经 ATO、普纳替尼及联合用药作用
              Ⅴ⁃FITC和5 μL PI，混匀后于室温避光孵育15 min，加                 48 h 后，Bcl⁃2 基因表达水平均较 DMSO 组明显下
              入结合缓冲液后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。                            降，差异均有统计学意义。但联合用药组与ATO组
              1.2.6  集落形成实验                                     和普纳替尼组相比，Bcl⁃2基因表达差异无统计学意
                  现制 1.2%和 0.7%琼脂糖，高压灭菌后置于                      义（图 2A）。3 组药物作用后，Bax 和 Caspase⁃3 基因
              55 ℃水浴锅中。配制青霉素及链霉素双抗，2 倍浓                         表达均较DMSO 组升高，且联合用药组与ATO 组和
              度的 RPMI⁃1640 培养基，20% FBS 培养基。将上述                  普纳替尼组相比，Bax 和 Caspase⁃3 基因表达上调更
              1.2%琼脂糖与培养基 1∶1 混合，加入 6 孔板，每孔                     加显著，差异均有统计学意义（图2B、C）。
              加入 1.5 mL。将细胞用 PBS 洗 2 遍，调整细胞浓度                        采用Western blot法检测Bcl⁃2、Bax蛋白表达及
              至 5×10 个/mL。铺上层胶，将 0.7%的琼脂糖与培                     Caspase⁃3 蛋白的活化情况，结果显示，与 DMSO 组
                     4
              养基 1∶1 混合，加入 100 μL 的细胞悬液，每孔加入                    相比，ATO 组和普纳替尼组凋亡相关蛋白 Bcl⁃2 表
              1.5 mL 体系。放入 37 ℃的 CO2培养箱培养，3 d 后                 达明显下降，而Bax及活化的Caspase⁃3蛋白表达明
              加培养基，约 3 周后固定细胞，结晶紫染色，计数克                         显上调，差异均有统计学意义。联合用药组与ATO
              隆形成。                                              组相比，Bcl⁃2 下调及 Bax、Cleaved Caspase⁃3 上调更

              1.3  统计学方法                                        加显著，差异明显。与普纳替尼组相比，联合用药可
                  采用 Graph Pad Prism5 软件进行统计学分析，                以促进 Cleaved Caspase⁃3 表达，差异有统计学意义
              数据以均数±标准差（x ± s）表示，不同药物干预效果                      （图2D、E）。
              的组间比较采用单因素方差分析，差异显著者进一                            2.4  ATO、普纳替尼及联合用药对KG⁃1细胞FGFR1

              步采用LSD法进行事后各组均值两两比较，P < 0.05                      表达及信号通路蛋白磷酸化水平的影响
              为差异有统计学意义。                                             普纳替尼作用后，FGFR1基因表达较DMSO组下
                                                                降明显，联合应用ATO后，FGFR1基因较普纳替尼组
              2 结 果
                                                                未进一步下降（图3A）。ATO可以显著降低m⁃TOR和
              2.1 ATO、普纳替尼单药对KG⁃1细胞的抑制效应                        MAPK、STAT5 磷酸化水平（图 3B~E），但对 PI3K/
                  经CCK⁃8检测发现，不同浓度ATO及普纳替尼                       AKT、STAT3 的磷酸化及 FGFR1 蛋白表达无明显影
   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53