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第44卷第10期 陈 露，张静静，时 坚，等. S100A4核定位在胰腺癌转移中的作用与机制研究［J］.
2024年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（10）：1323-1336，1434 ·1325 ·
（ubiquitin conjugating enzyme，UBC）9、SUMO1 等抗 值范围和计算方式同H⁃Score。
体（武汉ABclonal公司）。本实验所用细胞株（PANC 1.2.3 S100A4 SUMO化修饰位点的预测
⁃1、MIA PaCa⁃2）购自中国科学院细胞库。所用病毒 通过多个修饰位点预测网站JASSA、GPS⁃SUMO、
和质粒委托上海吉玛基因、上海和元生物技术、南 SUMOplot 等对 S100A4 氨基酸序列上的 SUMO 化修
京科瑞斯公司构建。 饰位点进行预测并交叉验证。
1.2 方法 1.2.4 细胞培养
1.2.1 免疫组织化学 将PANC⁃1和MIA PaCa⁃2细胞以含10%胎牛血
PC 组织芯片（产品目录号：HPanA060CD02 和 清、1% 青霉素⁃链霉素的 DMEM 完全培养基，置于
HPanA120Su02）由上海芯超生物有限公司提供，样 37 ℃、5%CO2培养箱中培养。
本 来 源 国 家 人 类 遗 传 资 源 共 享 服 务 平 台 1.2.5 质粒转染和病毒转导
（2005DKA21300）。HPanA120Su02 芯片包含 66 例 目的基因 UBC9、SENP1、SENP2、SENP3、内源
PC 及54例PC 癌旁样本，均具备完整的临床信息和 性 S100A4 沉默以及对照 Scramble 使用 pLV3ltr⁃Zs⁃
术后随访信息。随访截至 2014 年 11 月。HPan ⁃ Green⁃puro⁃U6 shRNA 载体。病毒转导取对数生长
A060CD02 芯片为 PC 病程芯片，包含正常人胰腺、 期的细胞，最佳MOI值下，加入含病毒培养基，加入
胰腺炎、PC癌旁/原发灶、PC转移灶和阴性/阳性淋巴 Polybrene 使其终浓度为 8 μg/mL。4~6 h 换新鲜培
结组织，每种组织类型 3~18 例，每例 1 点，共 60 点。 养基，24~48 h后换含最优浓度puromycin的培养基，
相关研究组临床病例信息详见网站 https：//www. 收获抗性细胞，经后续在蛋白或mRNA 水平鉴定后
superchip.com.cn. 组织芯片的使用由上海芯超生物 即得到稳转细胞系。
科技有限公司临床研究伦理委员会批准通过（YBM⁃ S100A4（野生型）、S100A4⁃K22R（第 22 位赖氨
05⁃02）。 酸突变成精氨酸）、S100A4⁃K96R（第 96 位赖氨酸
PC组织芯片烘片60 ℃，3 h，脱蜡及水化。然后 突变成精氨酸）和 S100A4⁃DKR（双位点突变）在
将切片置于修复液中煮沸（95 ℃，15~20 min），自然 pcDNA3.1（+）⁃EGFP过表达载体的基础上构建带有
冷却至室温。PBS洗涤3次，每次5 min。5%BSA室 HA 标签的表达载体。Flag⁃SUMO1、Flag⁃SENP1 和
温封闭 20 min；一抗 4 ℃过夜；PBS 洗涤 3 次，每次 Flag⁃UBC9 表达载体也由 pcDNA3.1（+）⁃EGFP 载
5 min；二抗孵育 37 ℃，15~30 min；PBS 洗涤 3 次，每 体构建。当细胞达到 70% 汇合度时，按照制造商
次 3 min；滴加 DAB 显色剂，镜下观察显色情况，及 的说明使用 Lipofectamine 3000 进行瞬时转染。通
时终止反应；苏木素复染2 min，冲洗后脱水，树胶封 过 RT⁃qPCR 或免疫印迹验证基因沉默或过表达的
片，镜检。 效率。
1.2.2 免疫组化结果判读与精准定量分析 1.2.6 Western blot
利用病理图像分析软件 HALO 的 HALO High⁃ 取对数生长期的PC细胞加入含有1% PMSF的
plex FL 分析模块对扫描结果进行半定量分析。所 RIPA 裂解液分离总蛋白。BCA 法测定蛋白质含
有同类图片分析用同一套分析模板，避免人为主观 量。按照 PAGE 凝胶快速制备试剂盒说明书制胶、
因素带来的影响。DAB 通道中的阳性程度由专业 上样、电泳。在快速转膜缓冲液中，400 mA电流转膜
病理人员先根据图像定义 0（阴性）、1（弱阳性）、3 40 min。5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭2 h。一抗
（强阳性）的阈值，2（中阳性）阈值是 1 和 3 的平均 4 ℃ 孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。辣根过
值。染色信号强弱除了通过阳性细胞数目及百分 氧化物酶（HRP）耦联的羊抗兔或鼠IgG二抗室温孵
比表示以外，还使用了更为客观精准的组织化学评 育2 h。TBST洗膜3次后进行ECL化学发光检测。
分（histochemistry score，H⁃Score）。H⁃Score 的取值 1.2.7 免疫共沉淀（Co⁃IP）
范围为 0~300，计算方式为：H⁃Score=［1×（% Cells 充分裂解样品后离心取上清进行免疫共沉
1+）+2×（% Cells 2+）+3×（% Cells 3+）］，其中% Cells 淀。向准备好的 Protein A+G 磁珠加入抗体工作液
1+、% Cells 2+、% Cells 3+分别代表弱、中、强阳性细 或正常IgG工作液重悬后室温翻转孵育1 h。TBS洗
胞的百分比。细胞核阳性强度也通过统计胞核阳 涤磁珠重复 3 次。样品与结合了抗体或正常 IgG 的
性细胞数目及百分比和组织化学评分（histochemis⁃ Protein A+G磁珠混合，置于旋转混合仪上，4 ℃孵育
try nuclei score，H⁃N⁃Score）来表示。H⁃N⁃Score的取 过夜。孵育完毕后，去除上清，使用含抑制剂裂解
