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第44卷第10期
               ·1326 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年10月


              液洗涤磁珠重复 3 次，SDS⁃PAGE 上样缓冲液洗脱，                     生存期（overall survival，OS）相关的预后影响因素。
              95 ℃加热 5 min，置于磁力架上分离 10 s，取上清用                   P < 0.05为差异有统计学意义。
              于SDS⁃PAGE电泳或Western检测。
                                                                2  结 果
              1.2.8 核质蛋白分离实验
                  按照制造商的说明使用 NE⁃PER™ 细胞核和细                      2.1  S100A4 高表达及细胞核定位与 PC 的转移特
              胞质提取试剂盒进行。胰酶消化收集细胞，PBS 洗                          征和不良预后正相关
              1 次。加入预冷的 CER Ⅰ，涡旋 15 s，冰上 10 min。                     为探究S100A4蛋白表达水平与PC病理进程的
              加入预冷的 CER Ⅱ，涡旋 5 s，冰上 1 min，涡旋 5 s，               相关性，本研究选择不同病程 PC 组织病理芯片（含
              16 000 g，离心 5 min。立即转移上清液（细胞质提                    位点60例）进行免疫组化分析。如图1A所示，从左
              取物），-80 ℃保存。将含有细胞核的不溶性沉淀用                         到右依次排列的是正常胰腺腺泡组织和逐级递
              预冷的NER 重悬，涡旋15 s，冰上10 min，重复4次。                   增 的 胰 腺上皮内瘤变（precancerous pancreatic in⁃
              离心后转移上清液（核提取物），-80 ℃保存。                           traepithelial neoplasias，PanIN）导管。正常胰腺腺泡
              1.2.9 划痕实验                                        组织细胞内 S100A4 表达阴性。各级 PanIN 导管上
                  在细胞达到90%的融合度后，用200 μL的移液                      皮细胞中 S100A4 呈阳性表达，定位于细胞胞质和
              器吸头划痕。用PBS冲洗净掉落的细胞，并于0 h和                        （或）胞核中。如图1B所示，从左到右依次排列的是
              24 h 在相同的位置进行拍照和记录。Image J 计算                     胰 腺 导 管 腺 癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，
              相对伤口面积。                                           PDAC），PDAC 浸润至胰周脂肪组织内，PDAC 的嗜
              1.2.10 Transwell侵袭实验                              神经浸润，PDAC 浸润或转移至胰周淋巴结，PDAC
                  在基质胶包被的上室加入 200 μL 无血清的                       肝脏转移灶。PDAC 癌细胞的胞质和（或）胞核中，
              DMEM制备的细胞悬液，在下室加入500 μL含10%                       S100A4 蛋白大多为强阳性表达。PDAC 最常见的
              FBS 的培养基，培养 24 h。用棉签轻轻擦拭上室的                       进展形式之一是浸润或侵袭，特别是对神经的浸润
              细胞，4%多聚甲醛固定 10 min，然后用 0.1%结晶紫                    或侵袭。在嗜神经浸润和脂肪浸润的PDAC的癌细
              染色 5~10 min，PBS 洗涤 3 次。在倒置显微镜下随                   胞的胞质和胞核中，S100A4 蛋白阳性染色强度增
              机评估10个视野（×200）。                                   加，与文献中报道一致          ［14］ 。浸润或转移的癌细胞的
              1.2.11 CUT&Tag                                    细胞胞质和胞核中，S100A4蛋白几乎全部为强阳性
                  使用 Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit    表达，提示高表达S100A4的癌细胞可能对肿瘤转移
              for Illumina进行CUT&Tag检测。连有刀豆蛋白A的                  具有一定的优势。为了更加客观地反映 S100A4 表
              磁珠结合细胞后，使用非离子去污剂洋地黄皂苷进                            达量及亚细胞定位与PC病理进程之间的关系，利用
              行细胞膜通透。然后，将抗 S100A4 抗体、相应二抗                       病理图像分析软件HALO对组织芯片免疫组化结果
              和 Protein A/G 一起孵育，使得与 Protein A/G 融合的            进行了半定量分析。通过对S100A4阳性细胞百分比
              转座子精准靶向切割目的蛋白附近的 DNA 序列。                          和反映 S100A4 染色强度的组织化学评分 H⁃Score、
              转座子在进行切割的时候，会在被切割的片段两端                            H⁃N⁃Score的计算，发现正常胰腺组织与胰腺炎组织
              加上接头序列，经 PCR 扩增后得到高通量测序文                          几乎不表达 S100A4，差异无统计学意义（P > 0.05，
              库。使用 Agilent 2100 生物分析仪对纯化的PCR产                   图 2A、C、D）。与正常胰腺组织相比，S100A4 在 PC
              物进行评估。最后，在Illumina NovaSeq 6000平台上                癌旁组织表达增加（P < 0.05），原发灶 S100A4 的表
              对文库进行测序。                                          达明显升高（P < 0.001），而转移灶中S100A4表达量

              1.3  统计学方法                                        最高（图 2B~D），说明 S100A4 既能先于组织细胞形
                  应用SPSS 24.0及GraphPad Prism 9软件进行统             态改变反映 PC 早期分子病理层面的变化，又能对
              计分析。实验数据均以均数±标准差（x ± s）表示，两                       PC 细胞转移起提示作用。值得注意的是，相比
              组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差                          S100A4 阳性细胞比例的指标，H⁃Score 纳入了单个
              分析。使用Kaplan⁃Meier方法估计各检测指标对患                      细胞 S100A4 染色强度的差异，能更清楚地反映
              者累积生存的影响，并通过Log⁃rank检验，分析各变                       S100A4 表达量差异，特别是 H⁃N⁃Score 能精准定量
              量与生存率的相关性。通过单因素和多因素Cox回                           S100A4在组织细胞中胞核的表达情况，进一步说明
              归模型估算风险比（hazard ratio，HR），以确定与总                   随 PC 病程进展，S100A4 强阳性的 PC 细胞比例和
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