Page 12 - 南京医科大学自然版

第44卷第10期
·1328 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年10月

A B
100 * *** * * *
% S100A4 positive cells 60
80

40
20
0
5 000 μm
Positive lymph node
Metastasis
Pancreatitis
Normal Adjacent tissue Negative lymph node
Primary tumor

C D
*** *** *
* *** * * *** ***
150 150
** ***
H⁃Score 100 H⁃N⁃Score 100

50 50

0 0
Primary tumor
Pancreatitis
Metastasis
Positive lymph node
Metastasis
Pancreatitis
Positive lymph node
Primary tumor
Normal Adjacent tissue Negative lymph node Normal Adjacent tissue Negative lymph node
A：Overall view of immunohistochemical staining of the PC tissue microarray in different stages（n=60）. B-D：The percentage of S100A4 positive
**
*
cells（B），H⁃Score（C），and H⁃N⁃Score（D）under different course of PC. P < 0.05，P < 0.01，and *** P < 0.001.
图2 不同病程PC S100A4蛋白水平表达情况
Figure 2 The expression levels of S100A4 protein in different course of PC
首先使用PC细胞MIA PaCa⁃2进行免疫共沉淀测定 expasy.org/生成了人类S100A4 3D蛋白质模型，并确
S100A4 SUMO 化情况。结果表明 S100A4 在 MIA 定第 22 位和/或第 96 位赖氨酸突变成精氨酸的
PaCa⁃2 细胞中与 SUMO1 或 SUMO2/3 共价结合，且 K22R/K96R 突变体 S100A4 与野生型的结构没有差
SUMO1起主要修饰作用（图4A）。 异（图 4D）。在敲低内源性 S100A4 基础上，同时转
大多数受SUMO修饰的底物蛋白都具有相同的 染 Flag⁃SUMO1 和 UBC9 以及 HA 标记的 S100A4（野
可修饰序列ΨKXE。其中，Ψ代表疏水性氨基酸，如 生型或不同的突变体），并通过CO⁃IP检测S100A4与
苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸等；K表示赖氨酸，是 SUMO1 结合情况。SUMO⁃S100A4 条带在突变体中
SUMO 修饰蛋白的结合位点；X 可以指代任意氨基 减少，尤其在S100A4⁃DKR双突变样本中。值得注意
［15］
酸；E则代表谷氨酸 。通过多个修饰位点预测网站 的是，在 37 kDa 及以上的位置未观察到 S100A4 条
（JASSA、GPS⁃SUMO、SUMOplot 等）对S100A4 SUMO 带，提示位点 K22 和 K96 在细胞中可能不会同时被
化修饰位点进行预测后发现 S100A4 两端分别存在 SUMO 化（图 4E）。以上实验结果表明，S100A4 是
一个可能被SUMO蛋白修饰的赖氨酸残基（Lys22和 SUMO化修饰的靶蛋白，且含有2个SUMO修饰位点。

Lys96）（图 4B）。随后通过比对不同物种间 S100A4 SUMO化修饰由 SUMO 活化酶 E1、E2 和 E3 酶
氨基酸序列发现，预测的 S100A4 SUMO 修饰位点 参与，而去 SUMO 化受 SUMO 特异性蛋白酶 SENP
K22 和 K96 在不同物种间高度保守（图 4C），提示 家族的调节 ［16］ 。成熟的 SUMO 蛋白与 E1 偶联，该
S100A4 普遍受 SUMO 修饰影响。为进一步验证 酶由两个亚基 SAE1/Aos1 和 SAE2/Uba2 组成。活
S100A4与SUMO蛋白的结合位点及其结合机制，本 化步骤由 ATP 水解生成高能 SUMO⁃E1 硫酯键，随
课题组构建了 S100A4 的 Lys22 和 Lys96 位点突变 后 SUMO 转移到 E2 酶。UBC9 是哺乳动物中目前

体。首先，通过 SWISS⁃MODEL（https：//swissmodel. 唯一已知的与靶蛋白结合的E2酶。最后，在 E3 连