Page 54 - 南京医科大学自然版

第44卷第11期
·1520 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年11月

（bp） M 1 2
Gene amplification
5 000
Purification
Ligation
3 000
2 000
1 000
835 bp
700 698 bp
500
250
100

M：DNA marker；1：Left arm of DNA fragment；2：Right arm of
Transforming Escherichia DNA fragment.
图3 PCR扩增Rv2647基因左、右臂片段
Figure 3 The left and right arm fragments of Rv2647
gene were amplified by PCR

Transforming Mycobacterium
Van91Ⅰ酶切的质粒 p0004S 转化 DH5α感受态细
胞。筛选阳性克隆子并测序。PacⅠ酶切并回收，
图2 M. tb的Rv2647基因回补株构建示意图 与 PacⅠ酶切的质粒 phAE159 连接、包装并转化
Figure 2 Schematic diagram of Rv2647 ⁃ complementary HB101 感受态细胞，筛选阳性噬菌粒并电转化感受
strain of M. tb
态 Ms，涂板，培养 3 d 后筛选噬菌斑，扩增制备高滴
Rv2647）的存活情况，分别于 30 d 和 7 d 后，颈椎脱 度噬菌体并感染H37Rv，涂板，37 ℃培养28 d后，挑
臼法处死模型鼠，无菌条件下取出模型鼠肺组织， 取单克隆，接种于 Middlebrook 7H9，37 ℃培养 28 d
无菌 PBS 漂洗后匀浆，梯度稀释后涂布于 Middle⁃ 后，提取基因组，PCR验证。以H37RvΔRv2647基因
brook 7H10，分别于培养 28 d 和 5 d 后进行菌落计 组为模板，可见大小约960 bp和1 190 bp的DNA 片
数，评估模型鼠肺组织细菌负荷。肺组织固定于 段。以 H37Rv 基因组为模板，未见目的 DNA 片段
4%多聚甲醛，常规脱水后石蜡包埋，5 μm 连续切 （图4）。
片。二甲苯脱蜡后利用梯度酒精水化，苏木精染色
（bp） M 1 2 M 3 4 M
后流水冲洗，用 1%盐酸乙醇进行分化，伊红复染，
流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片， 8 000
5 000
镜下观察，使用Image⁃Pro Plus软件进行肺组织炎症 3 000
2 000
评分，评估肺组织病理损伤程度 ［9-10］ 。 1 000 —1 190 bp
—960 bp
1.3 统计学方法 750
500
采用Graphpad prism 9.0进行统计分析，数据表 250
100
示为均值±标准差（x ± s）。两组间差异比较采用独
立样本t检验。多组间差异分析采用单因素方差分 M：DNA marker；1 and 3：wild type strain（H37Rv），primer pair
析。P < 0.05为差异有统计学意义。 LYZFP/LYZRP（1）and RYZFP/RYZRP（3）；2 and 4：Rv2647⁃deleted
strain（H37RvΔRv2647），primer pair LYZFP/LYZRP（2）and RYZFP/
2 结 果
RYZRP（4）.
图4 PCR验证H37RvΔRv2647
2.1 PCR扩增Rv2647基因左、右臂DNA片段
Figure 4 Verification of H37RvΔRv2647 by PCR
使用高保真 DNA 聚合酶扩增 H37Rv 的 Rv2647
基 因 左 臂 DNA 片 段（698 bp），右 臂 DNA 片 段 2.3 构建H37RvΔRv2647：：Rv2647
（835 bp），PCR可见明显条带（图3）。 PCR扩增Rv2647基因左、右臂并回收，与EcoRⅠ

2.2 构建H37RvΔRv2647 和 HindⅢ双酶切的 pMV361 质粒重组并转化 DH5α
酶切并回收 Rv2647 基因左、右臂 PCR 产物，与 感受态细胞，挑取单克隆测序验证 pMV361⁃Rv2647