Page 52 - 南京医科大学自然版

第44卷第11期
·1518 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年11月

M. tb Rv2647 protein on lung injury in model mice. Methods：A homologous exchange site was constructed and integrated into the
phage genomes of M. tb，producing phagemids that were introduced into Mycobacterium smegmatis（Ms）to create a recombinant phage
with a homologous exchange site. High⁃titer recombinant phages were amplified in vitro and transfected into M. tb（H37Rv），followed
by static culture at 37 ℃ for 28 d. The single clone was selected and verified by PCR，yeilding the Rv2647 ⁃ deleted strain
（H37RvΔRv2647）. The Rv2647 gene was amplified by PCR and was integrated into the multiple clone sites of vector pMV361 and
pMV261 through seamless cloning to obtain the positive plasmids，which were transfected into H37RvΔRv2647 and Ms to obtain the
Rv2647 ⁃ complemented strain（H37RvΔRv2647：：Rv2647）and Rv2647 ⁃ overexpressing Ms（Ms：：Rv2647），respectively. The
suspension of H37Rv，H37RvΔRv2647，H37RvΔRv2647：：Rv2647，Ms，and Ms：：Rv2647 were used to infect C57BL/6 mice via
tracheal injection. The survival rates，lung tissue bacterial load，and pathological damage of lung tissue in model mice were compared
at 7 d and 30 d，respectively. Results：The PCR showed that Rv2647 gene was missing in the H37RvΔRv2647，while it was present in
the H37RvΔRv2647：：Rv2647 and Ms：：Rv2647. The 30⁃day survival rates of model mice infected with H37RvΔRv2647，H37Rv，and
H37RvΔRv2647：：Rv2647 were 100.00%，83.33%，and 83.33%，respectively；The 7⁃day survival rates of model mice infected with Ms
and Ms：：Rv2647 were 100.00% and 83.33%，respectively. The lung bacterial load（lgCFU）of model mice in the H37RvΔRv2647
group（3.40±0.18）was significantly lower than that of the H37Rv group（3.86±0.15），P < 0.001）and the H37RvΔRv2647：：Rv2647
group（3.80±0.16），P < 0.01）；The inflammation area（%）in lung tissues of the H37RvΔRv2647 group（4.37±3.06）was significantly
lower than that of the H37Rv group（62.76±14.24），P < 0.001）and the H37RvΔRv2647：：Rv2647 group（67.37±0.45），P < 0.001）.
The lung bacterial load（lgCFU）of the Ms group（2.53±0.16）was significantly lower than that of the Ms：：Rv2647 group（2.81±0.13），
P < 0.01）；The inflammation area（%）in lung tissue of the Ms group（5.71±1.29）was significantly lower than that of the Ms：：Rv2647
group（33.13 ± 13.84），P < 0.05）. Conclusion：The Rv2647 ⁃ deleted strain（H37RvΔRv2647）and Rv2647 ⁃ complementary strain
（H37RvΔRv2647：：Rv2647）of M. tb and Rv2647⁃overexpressing Ms（Ms：：Rv2647）were successfully constructed. Rv2647 protein
may aggravate lung injury via inhibiting host clearance of M. tb.
［Key words］ Mycobacterium tuberculosis；regions of difference；Rv2647 protein；phage recombination technique；lung injury
［J Nanjing Med Univ，2024，44（11）：1517⁃1524］

结核病是结核分枝杆菌（Mycobacterium tubercu⁃ 损伤效应，为深入研究该蛋白在M. tb对宿主致病性
losis，M. tb）导致的严重传染性疾病，目前仍在全球 中的作用奠定基础。
范围内广泛流行。在感染宿主的过程中，M. tb可通
1 材料和方法
过进化方式逃避宿主免疫反应使之长期存活 。卡
［1］
介苗（bacillus calmette⁃guerin，BCG）是目前唯一可用 1.1 材料
的M. tb疫苗，对儿童播散性结核病可发挥有效预防 胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉（北京索莱宝生
［2］
作用，但对成人的长期保护效应有限 。比较基因 物科技公司）；氯化钠、甘油（上海生工生物工程有
组学研究发现，与野生株相比，BCG丢失了100多个 限 公 司 ）；Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10 及
基因编码序列，即所谓差异区域（regions of differ⁃ OADC（BD 公司，美国）；潮霉素 B（hygromycin B，
ence，RD），其包含了 16 个区域（RD1⁃RD16） 。研 HYG）、Tween⁃80（Sigma 公司，美国）；Trans2KPlusII
［3］
究表明，RD 可通过编码潜在效应蛋白在结核病发 DNA Marker、Trans15K DNA Marker（北京全式金生
病过程中发挥重要作用 ［4-5］ 。有关RD13区Rv2647基 物技术有限公司）；T4 DNA 连接酶、限制性内切酶
因编码蛋白对宿主的致病性研究既往未见报道。本 PacⅠ、Phusion High Fidelity DNA Polymerase（Thermo
研究运用噬菌体介导的基因重组技术分别构建了 Scientific公司，美国）；质粒提取试剂盒（北京天根生
H37Rv的Rv2647基因敲除株（H37RvΔRv2647）和回 化科技有限公司）；胶回收试剂盒、细菌基因组提取
补株（H37RvΔRv2647：：Rv2647）；Ms 被广泛用于 试剂盒（Omega 公司，美国）；MaxPlax Lambda 噬菌
TM
表达分枝杆菌蛋白，是研究 M. tb 致病机制的良好 体包装提取物（Epicentre生物技术公司，美国）。
模型 。Rv2647基因在Ms中缺失，本研究也构建了 1.2 方法
［6］
过表达 Rv2647 的 Ms（Ms：：Rv2647）；通过构建 M. tb 1.2.1 P0004S⁃ΔRv2647质粒构建
和Ms攻击模型评估Rv2647蛋白对模型鼠的肺组织 以结核分枝杆菌H37Rv全基因组DNA为模板，