Page 53 - 南京医科大学自然版
P. 53

第44卷第11期         金   霄，陈晓林，姚 静，等. 结核分枝杆菌Rv2647蛋白对肺组织损伤效应的初步研究［J］.
                 2024年11月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（11）：1517-1524                      ·1519 ·


                根据 Rv2647 基因序列，构建 Rv2647 基因的上游序                   细胞（电击参数：电压 2.5 kV，电阻 1 000 Ω，电容
                列（左臂，L）及下游序列（右臂，R），分别设计左臂                         25 μF），加入Middlebrook 7H9（HYG，75 μg/mL），37 ℃
                上、下游引物（LFP、LRP）、右臂上、下游引物（RFP、                     培养过夜后，菌液与适量 top agar 混匀并铺于 Mid⁃
                RRP），即 Rv2647⁃LFP（5′⁃TTTTTTTTCACAAAGTG⁃           dlebrook 7H10（HYG，75 μg/mL），30 ℃培养 2~3 d 后
                GACTCCCTGCCTAAGGTGCG⁃3′），Rv2647⁃LRP（5′⁃           筛选噬菌斑。
                TTTTTTTTCACTTCGTGGCGTGTTTTCGGAGCGTT ⁃             1.2.4 噬菌体扩增
                3′），Rv2647 ⁃ RFP（5′ ⁃ TTTTTTTTCACAGAGTGGA⁃            适量高滴度噬菌体裂解液与生长至对数期的
                CAACGCAACCCGCAGC ⁃ 3′ ），Rv2647 ⁃ RRP（5′ ⁃         分枝杆菌（MP buffer 预先洗涤）混匀，37 ℃孵育过
                TTTTTTTTCACCTTGTGCCGGACAGGCCGAGTTTG ⁃             夜，离心弃上清，加入适量 Middlebrook 7H9（HYG，
                3′）。通过聚合酶链反应扩增Rv2647。使用限制性                        75 μg/mL），37 ℃孵育过夜，离心弃上清液，收集菌
                内切酶Van91Ⅰ酶切P0004S质粒及Rv2647的左臂、                    体涂布于Middlebrook 7H10（HYG，75 μg/mL），37 ℃
                右臂，连接酶切后的片段并导入DH5α感受态细胞，                          培养28~42 d。
                挑取单克隆菌落，抽提质粒并验证。                                  1.2.5 Rv2647基因敲除株（H37RvΔRv2647）的构建
                1.2.2 PhAE159⁃ΔRv2647穿梭质粒构建                           高滴度噬菌体感染 H37Rv 后，涂布于 Middle⁃

                    PacⅠ酶切 P0004S⁃ΔRv2647 质粒和 PhAE159             brook 7H10（HYG，75 μg/mL），37 ℃培养28 d后，挑取
                质 粒 并 连 接 。 使 用 噬 菌 体 包 装 试 剂 盒 构 建               单克隆接种于 Middlebrook 7H9（HYG，75 μg/mL），
                PhAE159⁃Rv2647 穿梭质粒。转化 HB101 感受态细                 37 ℃培养28 d后，提取基因组，PCR验证（图1）。
                胞，挑取单克隆菌落抽提质粒并验证。                                 1.2.6 Rv2647基因回补株（H37RvΔRv2647：：Rv2647）
                1.2.3 筛选噬菌斑                                       的构建
                    PhAE159⁃ΔRv2647 穿梭质粒电转入 Ms 感受态                    PCR 扩增 Rv2647 基因，限制性内切酶 EcoRⅠ

                    L  Rv2647 R
                                                                                                HYG
                       HYG
                     L     R
                       AES
                      Shuttle
                      plasmid
                                Mycobacterium smegmatis               Mycobacterium tuberculosis  Mycobacterium tuberculosis mutant
                                              图1 M. tb的Rv2647基因敲除株构建示意图
                                        Figure 1 Schematic diagram of Rv2647⁃deleted strain of M. tb

                和HindⅢ 酶切Rv2647质粒和pMV361质粒，连接酶                    粒电转至Ms感受态细胞，涂布于7H10 固体培养基
                切产物，并将重组质粒导入DH5α感受态细胞，挑取                         （卡那霉素，30 μg/mL），37 ℃培养 3~4 d，挑取单克
                单克隆测序验证 pMV361⁃Rv2647 质粒。取适量                      隆接种至 7H9 液体培养基（卡那霉素，30 μg/mL），
                pMV361⁃Rv2647质粒电转化H37RvΔRv2647感受态                 37 ℃培养3~4 d，收集菌体，PCR验证。
                菌株，于 Middlebrook 7H10（HYG，75 μg/mL，卡那霉            1.2.8  Rv2647 蛋白对肺组织病理损伤效应的体内
                素，30 μg/mL）培养28 d后，挑取单克隆接种于Middle⁃                研究
                brook 7H9 液体培养基（HYG，75 μg/mL，卡那霉素，                    分别用H37Rv、H37RvΔRv2647和H37RvΔRv2647

                                                                                6
                30 μg/mL），37 ℃培养 28 d 后，收集菌体并进行PCR                ：：Rv2647（2×10 CFU/只）以及Ms和Ms：：Rv2647（1×
                验证（图2）。                                           10 CFU/只）气管攻击C57BL/6小鼠         ［7-8］ ，腹腔注射三
                                                                    7
                1.2.7  过 表 达 Rv2647 的 耻 垢 分 枝 杆 菌（Ms：：            溴乙醇麻醉小鼠并固定于操作台，充分消毒后切开
                Rv2647）的构建                                        颈部皮肤，钝性分离气管旁肌肉组织，暴露气管，使用
                    PCR 扩增 Rv2647 基因，回收目的 DNA 片段与                 1 mL注射器通过气管注射上述菌液，注射结束后立
                线性化的双酶切 pMV261 质粒（EcoRI 和 HindⅢ）重                 即竖直放置小鼠，轻轻摇晃，缝合颈部皮肤后再次消
                组并转化 DH5α感受态细胞，挑取单克隆测序验证                          毒。监测模型鼠 30 d（H37Rv、H37RvΔRv2647 及
                pMV261⁃Rv2647 质粒。取适量 pMV261⁃Rv2647 质              H37RvΔRv2647：：Rv2647）和 7 d（Ms 和 Ms：：
   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58