Page 42 - 南京医科大学学报自然科学版

第44卷第2期
·180 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年2月

张切片随机选取6个视野，取平均值计算辐射肺泡状 1.2.6 Western blot
计数（radical alveolar counts，RAC），并根据Masson染 提取各组新生 SD 鼠肺组织及 HFL⁃1 细胞的总
色结果参考文献［11-12］进行纤维化评分。 蛋白，使用BCA法测定总浓度，然后在SDS⁃PAGE凝
1.2.3 RT⁃qPCR 胶电泳中分离蛋白质样品并湿转到 PVDF 膜上，之
提取肺组织总 RNA 后，使用逆转录试剂盒逆 后脱脂牛奶溶液封闭 1 h 后与以下一抗 4 ℃孵育
转录为 cDNA，按照聚合酶链反应试剂盒说明加入 过夜：α⁃SMA（1∶1 000）、TGF⁃β1（1∶1 000）、Smad2
2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL、cDNA 1 μL、前 引 物 （1∶500）、p⁃Smad2（1∶2 000）、Smad3（1∶1 000）、
（10 μmol/L）0.5 μL 和后引物（10 μmol/L）0.5 μL，最 p⁃Smad3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。TBST 洗膜后
后ddH2O定容至25 μL后在实时荧光定量PCR仪器 与二抗室温孵育1 h，最后使用超强发光液在凝胶成

上进行 PCR 扩增。引物序列为：TGF⁃β1 F：5′⁃CCT⁃ 像系统进行曝光Image J 软件定量分析。
GGACACACAGTACAGCA⁃3′；TGF⁃β1 R：5′⁃CCACG⁃ 1.3 统计学方法
TAGTAGACGATGGGC ⁃ 3′ ；α ⁃ SMA F：5′ ⁃ CATCC⁃ 所有数据采用统计软件SPSS 27.0进行分析，计
GACCTTGCTAACGGA⁃3′；α⁃SMA R：5′⁃CCACATA⁃ 量资料以均数±标准差（x ± s）表示，采用单因素方差
CATGGCAGGGACA⁃3′。 分析比较各组数据，LSD⁃t 检验进行两两比较。P <
1.2.4 HFL⁃1细胞分组及处理 0.05为差异有统计学意义。
取对数生长期的 HFL⁃1 细胞分为 3 组，即空气
2 结 果
组、高氧组及CTS干预组，均匀铺于6孔板，细胞饥饿
12 h后干预组予CTS 10 μmol/L处理，高氧及空气组 2.1 CTS对新生SD大鼠肺组织病理学影响
加入等量的溶剂DMSO，随后高氧组及CTS干预组置 HE染色显示高氧组较空气组肺泡结构紊乱，肺
于95％O2、5％CO2、37 ℃恒温培养箱中培养24 h。 泡形态变大，数目减少，RAC值下降（P < 0.05）；不同
1.2.5 CCK⁃8测定HFL⁃1细胞活力 剂量的CTS干预后肺泡形态好转，RAC值也较高氧组
HFL⁃1细胞以5×10 个/mL的密度均匀铺于96孔 明显上升（P < 0.05，图1）。
4
板，并在培养箱中培养过夜，将不同浓度溶于DMSO Masson 染色结果显示，与空气对照组相比，
的CTS（0、2.5、5.0、10.0 μmol/L）处理细胞24 h，之后 高氧组胶原纤维含量明显上升，肺泡排列不规
每孔加入 10 μL 的 CCK⁃8 溶液继续孵育 2 h，使用 则，肺泡间隔增厚。CTS 干预后纤维化评分较高
酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光度值，每孔设 氧组降低，其中高剂量的 CTS 效果最好（P < 0.05，
4个复孔取平均值，重复实验3次。 图 2）。
Air Hyperoxia CTS 7.5 mg/kg CTS 15 mg/kg CTS 30 mg/kg

15

10 #
#
RAC * #
5

0
CTS 7.5 mg/kg
CTS 30.0 mg/kg
Hyperoxia CTS 15.0 mg/kg
Air
Compared with the air group，P < 0.05；Compared with the hyperoxia group，P < 0.05（n=3）。
#
*
图1 SD新生大鼠肺组织HE染色（×100）
Figure 1 HE staining of lung tissue from neonatal SD rats（×100）