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第44卷第3期         张  平，徐云燕，陈 莹，等. 基于可降解两性离子聚碳酸酯纳米胶束的设计合成及其血液长
                  2024年3月                循环研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（3）：329-335                    ·331 ·


                态光散射（dynamic light scattering，DLS）仪（安东帕           1.2.5 体内长循环实验
                公司，奥地利）测量纳米颗粒大小。纳米胶束的蛋                                采用体重 220~400 g ICR 雄鼠为模型，按照
                白稳定性实验通过向纳米胶束溶液中加入 10%牛                           18 mg/kg 的剂量尾静脉注射纳米胶束溶液，在不同
                血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），再利用 DLS            时间点（0.2、0.5、1、2、4、8、26 h）通过眼眶取血收集
                以观测24 h后的纳米胶束粒径变化。                                血样。加入裂解液（1% Triton X⁃100）和有机试剂
                1.2.3 细胞毒性测试、溶血实验                                 DMF，放入 37 ℃摇床内过夜。离心并收集上清液，
                    采用 MTT 法，以人宫颈癌细胞（HeLa）为模型，                    酶标仪检测荧光强度（扫描范围649~680 nm）。
                测试聚合物PAC（TCB）和PEG⁃PCL的细胞毒性。将                      1.3  统计学方法
                HeLa细胞接种于96孔板（细胞密度为1.0×10 个/孔），                       数据分析使用GraphPad Prism软件进行，数据使
                                                       4
                置于 37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养过夜，加入                      用均数±标准差（x ± s）表示，两组比较采用Student⁃t
                不同浓度的 PAC（TCB）、PEG⁃PCL 溶液，继续培养                    检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                48 h后，每孔加入MTT试剂，继续培养4 h，最终利用
                                                                  2  结 果
                酶标仪进行紫外吸光度检测。
                    红细胞破裂法评价两性离子PAC（TCB）胶束的                       2.1  两性离子聚碳酸酯PAC（TCB）的合成
                溶血毒性。将新鲜小鼠血液离心并收集红细胞，经                                以 AC 为单体，异丙醇为引发剂，在双（双三甲

                PBS 洗涤 5 次后，用无菌的 0.9%生理盐水将 0.2 mL                 基硅基）胺锌的催化下，发生开环聚合反应得到了
                的红细胞稀释至 4 mL（5%血细胞比容）。接着，将                        分布较窄的 PAC 聚合物（聚合物分散指数为 1.3）；
                不同浓度的纳米胶束溶液加入到 100 mL 稀释好的                        TCB 分子通过 Michael 加成反应修饰到聚合物 PAC
                红细胞溶液中，37 ℃ 4 h 后，离心并收集上清液，用                      的双键侧链上，得到聚合物PAC（TCB）（图1）。核磁
                紫外分光光度计检测吸光度（λ=542 nm）。蒸馏                         氢谱结果显示（图2A），根据异丙醇端甲基（δ 1.1）和
                水、0.9%的生理盐水孵育稀释的红细胞悬浮液分别                          侧链上双键（δ 6.3）的峰面积积分比得到 PAC 分子
                作为阳性对照和阴性对照。溶血百分比计算公式                             量为 8 000；PAC（TCB）聚合物侧链上的双键完全消
                如下：                                               失（图 2B），表明 TCB 成功接枝到聚合物 PAC 上，通
                    溶 血 率（%）=（Dsample- DNegative ）/（DPositive- DNegative ）×  过计算得到聚合物 PAC（TCB）的分子量为 22 000。
                100%（其中Dsample为纳米胶束孵育后上清液的紫外吸                     此外，PAC⁃PCL、PAC（TCB）⁃PCL和PEG⁃PCL聚合物
                光度值，DNegative为0.9%生理盐水孵育后上清液的紫外                   同样通过开环聚合和 Michael 加成后聚合修饰成功
                吸光度值，DPositive为蒸馏水孵育后上清液的紫外吸光                     合成，分子量分别为8 200、11 500和11 300，聚合物
                度值）。                                              分散指数分别为1.34，1.40和1.21。
                1.2.4 细胞摄取实验                                      2.2  胶束的表征与稳定性
                    HeLa 细胞以 1.0×10 个/孔的密度铺于 24 孔板                    胶束溶液采用溶剂交换法制备得到。PAC（TCB）
                                      5
                中，置于含5% CO2、恒温37 ℃细胞培养箱中培养过                       和 PAC（OEG）胶束的水合粒径分别约为 160 nm 和
                夜，每孔加入 Cy5 标记的纳米胶束溶液（4 mg/mL，                     250 nm（图 3A），两性离子型纳米胶束粒径略小于
                50 mL），继续孵育1 h和6 h，通过荧光显微镜观察细                     PEG 类，这是因为两性离子基团的水合能力比 PEG
                胞对纳米粒子的内吞行为。同时，采用流式细胞仪                            更强。为了观察胶束与蛋白的相互作用力，分别向
                定量分析细胞对不同纳米胶束的内吞能力。                               PAC（TCB）、PAC（OEG）、PEG⁃PCL 和 PAC（TCB）⁃


                      O
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                              HOPr                          TCB
                                          O  O       O  x            O  O      O
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                                                                               S        S     N     N +     -
                                                                                   O                     COO
                                                                                     2
                                                                                             O
                      AC                        PAC                               PAC（TCB）
                                                  图1  PAC（TCB）聚合物的合成路线
                                            Figure 1  Synthetical route of PAC（TCB）polymer
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