Page 100 - 南京医科大学自然版

第44卷第4期
·538 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年4月

GST与固定在树脂上的谷胱甘肽（glutathione，GSH） 1.4 串联亲和纯化（tandem affinity purification，TAP）
结合的原理，通过重组技术将GST与诱饵蛋白融合， TAP 技术最早由德国 Rigaut 等 ［27］ 发明，并在鉴
融合蛋白可与固相化在载体上的GSH亲和结合 ［23］ ， 定酵母菌蛋白复合物中获得成功，随后被应用于其
当与融合蛋白有PPI的蛋白通过层析柱或与此固相 他细胞系及组织 ［28］ 。TAP技术首先需通过基因工程
复合物混合时，可被吸附，形成GSH⁃GST⁃探针蛋白⁃ 给诱饵蛋白的 N 端或 C 端加一个 TAP 标签 ［29］ ，TAP
猎物蛋白复合物，从而分离出与探针蛋白有相互作 标签由钙调蛋白结合肽（calmodulin binding peptide，
用的猎物蛋白（图 3），可通过 Western blot或质谱技 CBP）⁃ TEV 蛋白酶切位点⁃金黄色葡萄球菌蛋白 A
［24］
术鉴定猎物蛋白 。 的IgG结合结构域构成 ［30］ 。含有TAP标签的融合蛋
GST Pull⁃down 实验可以验证蛋白质之间的直 白粗提取物通过IgG亲和柱，温和洗涤后，大多数无
接PPI，只要猎物蛋白与诱饵蛋白之间有PPI的结构 法与诱饵蛋白结合的蛋白质被洗涤掉，IgG 亲和柱
基础就可以被提取，徐国双等 ［25］ 利用GST Pull⁃down 上吸附了蛋白A⁃TEV蛋白酶切位点⁃CBP⁃诱饵蛋白⁃
联合质谱技术筛选到39种与H7N9亚型禽流感病毒 猎物蛋白复合物（图4 A）。加入TEV蛋白酶从蛋白
（avian influenza virus，AIV）核糖体移码蛋白PA⁃X互 复合物中切割掉第一标签即蛋白 A，从柱中洗涤出
作的候选蛋白，为深入探讨PA⁃X在AIV生命周期中 CBP⁃诱饵蛋白⁃猎物蛋白复合物（图4 B）。再将此复
的作用机制奠定基础。但是 GST Pull⁃down 是在体 合物通过第 2 个含钙调蛋白的柱基质，在钙离子存
外进行生化反应验证蛋白质的相互作用，不能够 在下，CBP就会与钙调蛋白紧密结合，用含有EGTA
完全反映细胞内蛋白真实的互作状态，且融合蛋 的洗脱液进行温和洗脱，即可得到高纯度的诱饵蛋
白中的 GST 标签可能会影响诱饵蛋白原有的折叠 白⁃猎物蛋白复合物（图4 C）。
结构 ［26］ 。 TAP 技术经过两次洗脱，减少了非特异性的蛋

Expression of fusion proteins

GST Bait
Elution
Wash
GSH GSH GST Bait GST Bait

Cell lysate

图3 Pull⁃down实验原理
Figure 3 Principle of Pull⁃down

［32］
［31］
白结合，提高了特异性 ，Li等 通过TAP⁃MS联用技 因，首次提出了 PDT 的概念。PDT 的原理是将外源
术，鉴定出了真菌细胞中非常低水平的PPI。TAP标 基因通过基因工程技术插入到编码噬菌体外壳蛋
签种类多样，适用广泛且实用性强，Berneking等 利 白的基因序列中，从而在噬菌体的表面表达特定的
［33］
［36］
用 CBP 和链霉亲和素结合肽（streptavidin⁃binding⁃ 外源蛋白 。
peptide，SBP）标签鉴定与耶尔森菌效应蛋白YopM相 PDT是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛
［34］ ［37］
互作用的新蛋白，Tani等 利用3×FLAG（DYKDDDDK 应用到蛋白质相互作用研究中的 。该技术的突
肽）标签与人流感病毒血凝素（human⁃influenza⁃virus 破性贡献在于可将基因型与表型紧密连接 ［38］ 。龙
hemagglutinin，HA）标签并通过与质谱法相结合，以 晨等 ［39］ 利用PDT 筛选与草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白
鉴定与肌动蛋白相关蛋白 Arp2 有相互作用的蛋白 相互作用的多肽，经过 NCBI 比对后发现草鱼基因
复合物的成分。TAP技术的局限性主要在于TAP标 组中有 7 个基因与筛出的多肽具有同源性，表明其
签的引入可能会影响靶蛋白和亲和柱的结合，纯化 可能与VP39存在相互作用。
过程中TEV蛋白酶与EGTA或其他溶剂的使用可能 1.6 蛋白质芯片
会干扰复合物的完整性和活性。 蛋白质芯片技术是指将蛋白质或多肽等固定

1.5 噬菌体展示（phage display technology，PDT） 在支持介质表面，捕获能与之特异性结合的待测蛋
［35］
1985 年，Smith 利用丝状噬菌体表达外源基 白，用于样品成分和蛋白质之间相互作用的分析，