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第44卷第4期 陈佳丽，夏 天，周其冈. 检测蛋白质相互作用方法的进展［J］.
2024年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（04）：536-545 ·539 ·

A
TAP tag
Wash

Bait protein
B
TEV protease cleavage Prey protein
Calmodulin binding peptide（CBP）
TEV protease cleavage site
C
Protin A
+EGTA
IgG beads
Calmodulin beads
Ca 2+
A：First affinity column，binding of TAP labeled fusion proteins on IgG agarose affinity columns. B：Second affinity column，binding on a calmodu⁃
lin agarose affinity column. C：Mild elution using eluent containing EGTA.
图4 串联亲和纯化原理
Figure 4 Principle of tandem affinity purification

亦称蛋白质微阵列 ［40］ 。张旭东等 ［41］ 使用蛋白质芯 测定和 Duolink 邻近连接测定发现耳聋相关蛋白
片技术结合多变量分析方法分析骨骼肌组织中的 TMEM43和TASK⁃1蛋白存在直接相互作用 。
［48］
蛋白质变化来进行死亡时间推断。 1.9 邻近依赖性生物素化测定与质谱联用（proxi⁃mity⁃
1.7 双分子荧光互补（bimolecular fluorescence com⁃ dependent biotinylation coupled to mass spectrometry，
plementation，BiFC） PDB⁃MS）
BiFC是通过切割荧光蛋白的特定位点，形成没 在过去 10 年中，酶介导的邻近标记（proximity
有荧光的N⁃端和C⁃端，分别与待研究的目标蛋白融 ligation，PL）技术已成为在活细胞中定位蛋白质和
合表达。若目标蛋白间发生相互作用，两个不完整 RNA的强大工具。在这些方法中，工程酶在特定亚
的荧光片段则相互靠近形成完整的有活性的荧光 细胞位置表达并催化高反应性小分子中间体的原
基团，从而在激发光下发出荧光 ［42］ 。BiFC测定是一 位合成，随后扩散并与蛋白质和/或 RNA 反应产生
种将活细胞中PPI可视化的方法 ［43］ 。Feng等 ［44］ 利用 共价标记 ［49］
BiFC 技术通过标记内源性蛋白质将秀丽隐杆线虫 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
［45］
中的内源性突触可视化，Don等 通过将BiFC与斑 在芳基叠氮化物⁃生物素试剂存在时会产生一种活
马鱼模型系统相结合，研究肌萎缩侧索硬化症（amyo⁃ 性自由基物质，标记距离酶200~300 nm范围内的蛋
trophic lateral sclerosis，ALS）中的蛋白聚集体形成和 白质 （图6）。
［50］
定位。 抗 坏 血 酸 过 氧 化 物 酶（ascorbate peroxidase，
1.8 邻近连接测定（proximity ligation assay，PLA） APEX）在过氧化氢存在下，将外源性添加的生物素⁃
PLA也称为Duolink PLA技术，允许在内源性蛋 苯酚（也称为生物素基酪胺）转化为高反应性、不稳
［46］
白质水平上原位（距离 < 40 nm）检测 PPI 。该方 定的生物素⁃酚类自由基，进而将其附近的蛋白质生
法依赖单个一抗与两种假定存在相互作用的蛋白 物素化 （图6）。
［51］
质的特异性结合。一抗需要来自不同的宿主。含 BioID 是基于大肠杆菌中的混杂生物素连接酶
有互补寡核苷酸的针对两个宿主的二抗附着在一 BirA*（R118G 位点被突变）的融合诱饵蛋白，生物
抗上。如果两种抗原非常接近（可能彼此相互作 素连接酶通过生物素和三磷酸腺苷生成一种高活
用），互补寡核苷酸可以退火，荧光核苷酸可以掺入 性的生物素酰⁃5′⁃AMP（Bio⁃AMP）中间体，Bio⁃AMP
单个 DNA 聚合步骤中（图 5）。在显微镜下，这些反 可以接近依赖性的方式与周围蛋白质上可接近的
［52］
应显示为点状荧光斑点，表明 PLA 反应成功，并提 赖氨酸侧链反应，使蛋白质生物素化 （图6）。
［47］ ［48］
示两种抗原之间存在 PPI 。Jang 等 利用 Co⁃IP BioID 技术相对上述两种方法有简单、无毒的