Page 28 - 南京医科大学自然版
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第44卷第6期
               ·764 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年6月


              1.2.6 Transwell实验                                 相比，在 PTC 组织（图 1B）和 PTC 细胞株（图 1C）中，
                  每孔2×10 个细胞铺于6孔板中，贴壁后分别转                       UBE2T蛋白表达水平均显著升高（P < 0.01）。
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              染质粒。48 h后收集对数生长期细胞，使用细胞计数                         2.2  UBE2T 表达水平升高与 PTC 预后不良及淋巴
              板计数后，无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度为                           结转移相关
              1×10 个/mL，混匀。下室加入500 μL 全培养基，上室                        利用 TCGA⁃THCA 数据库，对 UBE2T 表达与患
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              加入200 μL细胞悬液（侵袭实验需在Transwell 上方                   者临床病理特征进行深入分析。结果表明，UBE2T
              小室中加基质胶），放入37 ℃细胞培养箱，TPC⁃1细胞                      高表达与患者 DFI 缩短显著相关，高表达组的 DFI
              培养24 h、KTC⁃1 细胞培养 18 h。取出小室，PBS 清                 明显更短［图 1D，HR=3.43，95%CI：1.43~8.21，P <
              洗 2 遍，4%多聚甲醛固定 15 min，0.1% 结晶紫染色                  0.05］。 此 外 ，还 观 察 到 淋 巴 结 转 移 组（N1）的
              20 min，去除未与细胞结合的结晶紫及小室上侧未迁                        UBE2T表达水平比淋巴结无转移组（N0）更高，差异
              移的细胞，然后在显微镜下观察计数。                                 有统计学意义（图1E，P < 0.01）。
              1.2.7 划痕实验                                        2.3  敲减UBE2T抑制PTC细胞增殖、迁移、侵袭

                  在 6 孔板的底部平均划 3 条横线，随后按照 2×                         采用2种PTC细胞TPC⁃1和KTC⁃1，转染质粒进
              10 个/孔细胞铺于 6 孔板中，贴壁后分别转染质粒。                       行UBE2T敲减，Western blot验证敲减效果，结果显示
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              48 h 后用 20 μL 的枪头在 6 孔板中划 2 条竖线。用                 与对照组相比，UBE2T的表达显著降低，差异均有统
              PBS 洗去漂浮的细胞，观察 12~48 h，记录划痕愈合                     计学意义（图2A）。
              情况。                                                    利用CCK⁃8法检测UBE2T敲减后对细胞增殖的
              1.2.8 生物信息学分析                                     影响，结果表明，敲减 UBE2T 能显著抑制 TPC⁃1 和
                  从 UCSC 癌 症 浏 览 器（https：//xenabrowser.net/     KTC⁃1的增殖活力（图2B，P < 0.001）。同时，验证了
              datapages/）获取 TCGA⁃THCA 数据集的基因表达数                 敲减 UBE2T 能显著抑制 PTC 细胞的集落形成能力
              据。使用 R 软件（版本 4.2.1）进行配对样本 t 检验。                  （图2C，P < 0.01）。
              通过 R 软件包 survival 中的 survfit 函数分析两组无                   划痕实验进一步探究 UBE2T 对 PTC 细胞迁移
              疾病间隔（disease⁃free interval，DFI）的差异，并使用            和侵袭的影响。结果显示，UBE2T敲减后划痕愈合
              Logrank 检验评估不同组样本之间 DFI 差异的显著                     速度较为缓慢，提示UBE2T敲减可抑制PTC细胞的
              性。使用非配对的Student’s t检验进行淋巴结无转                      迁移（P < 0.001，图 3A；P < 0.01，图 3B）。Transwell
              移（N0）与淋巴结转移（N1）组间的差异显著性分                          实验验证，发现UBE2T敲减后，TPC⁃1和 KTC⁃1细胞
              析。使用基因集富集分析（gene set enrichment anal⁃             的迁移和侵袭数目明显减少（图 3C、D，P < 0.01），进
              ysis，GSEA）软件（3.0 版本，http：//software.broadinsti⁃   一步说明 UBE2T 敲减可以抑制 PTC 细胞的迁移和
              tute.org/gsea/index.jsp）按照 UBE2T 的表达水平高低          侵袭。
              排序，前 50%为高表达组，后 50%为低表达组，以评                       2.4  UBE2T参与JAK⁃STAT信号通路
              估相关途径和分子机制。                                            为了进一步探究 UBE2T 促进 PTC 细胞增殖迁
              1.3  统计学方法                                        移侵袭的机制，根据 TCGA⁃THCA 样本中 UBE2T 的
                  实验数据通过Graphpad Prism 9.0 统计软件进行               表达水平将样本分为 UBE2T 高表达组和 UBE2T 低
              分析并制图。两组间的比较使用 Student’s t 检验，                    表达组，并进行了 GSEA，结果显示 UBE2T 参与了
              ANOVA单因素方差分析用于多组间的比较。每组                           JAK⁃STAT 信号通路（图 4A）。接着，在 TPC⁃1 和
              实验均重复3次，P < 0.05为差异有统计学意义。                        KTC⁃1 细胞中敲减 UBE2T 后，检测了STAT3的磷酸
                                                                化水平。Western blot 结果显示，相比对照组，敲减
              2  结 果
                                                                UBE2T 后 STAT3 磷酸化水平显著下调（图 4B，P <
              2.1  UBE2T在PTC组织和细胞系中表达水平升高                       0.001），提示 UBE2T 可能通过调控 JAK⁃STAT 信号
                  在对TCGA数据库中PTC组织及其相应癌旁正                        通路促进PTC细胞的增殖、迁移和侵袭。
              常组织的 RNAseq 数据进行差异分析，生物信息学                        2.5  UBE2T通过激活JAK⁃STAT信号通路促进PTC
              分析结果表明相比癌旁正常组织，PTC中UBE2T的                         细胞增殖
              表达量显著升高（图 1A，P < 0.001）。通过 Western                     进 一 步 使 用 STAT3 激 活 剂 Colivelin 来 探 究
              blot 检测发现，与癌旁正常组织及甲状腺正常细胞                         STAT3 在 UBE2T 介导的 PTC 细胞功能变化中的关
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