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第44卷第6期         张丽君，李     琳，斯 岩，等. UBE2T通过JAK⁃STAT通路促进甲状腺乳头状癌细胞增殖［J］.
                  2024年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（6）：762-768                        ·763 ·


                                                           ［1］
                    甲状腺癌是内分泌系统最常见恶性肿瘤之一 ，                         本研究经医院伦理委员会批准（伦理号：2023⁃SR⁃
                近 20 年全球绝大多数国家及地区的甲状腺癌发病                          425），所有参与者均签署书面知情同意书。正常
                率均呈现出暴发式增长，已跃升为恶性肿瘤第8位、                           甲状腺细胞系 Nthyori 3⁃1 和 PTC 细胞系 TPC⁃1、
                女性第 4 位高发的肿瘤        ［2-3］ 。根据 2022 年国家癌症          KTC⁃1、B⁃CPAP、IHH4 由本实验室保存。
                中心发布的报告，我国甲状腺癌发病率从1990年的                              RPMI⁃1640 培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美
                1.40/10 万上升至 2016 年的 14.65/10 万，增长了近              国）；CCK⁃8 试剂盒（K1018，ApexBio 公司，美国）；
                10 倍，其病死率也呈缓慢上升趋势 。人甲状腺乳                          Lipo8000（C0533，杭州碧云天公司）；UBE2T 单克隆
                                               ［4］
                头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺          抗体（MA5⁃25226，上海赛默飞公司）；STAT3 单克
                                                      ［5］
                癌最常见的亚型，约占所有甲状腺癌的90% 。PTC                         隆抗体（4904T）、磷酸化 STAT3 抗体（9134T）（Cell
                生长较缓慢，总体预后较好，但30%~80%的PTC患者                       Signaling Technology 公司，美国）；GAPDH（60004⁃1⁃
                在确诊时即存在颈部淋巴结转移 。PTC复发率为                           Ig，Proteintech 公司，美国）；羊抗兔二抗（A0208）、羊
                                             ［6］
                10%~35%，其中80%的患者在术后10年内复发。各                       抗鼠二抗（A0216）（杭州碧云天公司），STAT3 激活
                种异常改变的基因和异常激活的通路相互影响，构成                           剂 Colivelin（HY⁃P1 061A，MCE 公司，美国）；sh⁃
                复杂的网络共同影响甲状腺癌的发生发展 。因此，                           UBE2T及对照sh⁃Vehicle 质粒由上海吉凯基因公司
                                                     ［7］
                进一步探究与其发生发展相关的功能基因，寻找新的                           设计合成。
                潜在诊断和治疗靶点有重要的临床意义。                                1.2  方法
                    蛋白质翻译后修饰是调控蛋白功能的关键步                           1.2.1 细胞培养
                骤，包括泛素化、过硫化、甲基化、乙酰化和脂质化                               细胞均使用含有10%胎牛血清、1%青霉素和链
                  ［8］
                等 。泛素化通过泛素⁃蛋白酶体系统（ubiquitin                       霉素的 RPMI⁃1640 完全培养基，放入 5%CO2、37 ℃
                proteasome，UPS）在细胞增殖、凋亡、周期阻滞、DNA                  恒温培养箱中培养，2~3 d换液，使细胞维持在对数
                复制及修复等多个生物过程中发挥重要作用                      ［9-10］ 。  生长期。
                泛素级联反应分为三步骤：泛素激活酶E1在ATP供                          1.2.2 质粒转染
                能下活化泛素分子，活化的泛素分子传递至泛素结                                收集处于对数生长期的细胞，使细胞浓度达到
                合酶 E2 的半胱氨酸巯基，最终由泛素连接酶 E3 特                       6×10 个/mL，按 2 mL/孔将细胞铺于 6 孔板中，待次
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                异性识别并连接到靶蛋白上             ［11］ 。其中，泛素结合酶           日细胞密度达到80%~90%时使用 Lipo8000 按照说
                E2是底物识别和泛素级联反应的关键决定因素 。                           明书进行质粒转染。
                                                          ［12］
                    泛素结合酶E2T（ubiquitin⁃binding enzyme E2T，        1.2.3 细胞克隆形成实验
                UBE2T）属于泛素结合酶 E2 家族，在泛素级联反应                            将细胞按照 2×10 个/孔数铺于 6 孔板中，贴壁
                                                                                      5
                的第二步发挥作用。越来越多的证据表明                        ［13］ ，  后分别转染质粒。48 h 后收集对数生长期细胞，使
                UBE2T在多种癌症中高度表达，如宫颈癌、胆管癌、                         用细胞计数板计数后，每孔接种约 400 个细胞。放
                结直肠癌、食管癌、肺癌、胰腺癌等              ［14-16］ ，并通过多条      入培养箱中培养 14 d，视情况换液，14 d 后用 3%多
                途径促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭，这提示靶向                             聚甲醛固定，结晶紫染色，拍照计数。
                UBE2T 可能是一种有前景的肿瘤治疗方法，然而，                         1.2.4 CCK⁃8
                UBE2T 在甲状腺癌中的表达及其生物学分子机制                              将细胞按照每孔 100 μL、2×10 个细胞铺于 96
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                仍不清楚。本研究探讨了 UBE2T 在 PTC 中的表达                      孔板中，5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，每
                及其对患者预后的影响，以及UBE2T在PTC细胞中                         孔加入 10 μL CCK⁃8 溶液，培养箱孵育 1.5 h，测定
                的功能及其可能的调控机制，为PTC 的治疗提供新                          450 nm吸光度。
                的研究方向。                                            1.2.5 Western blot

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                1  材料和方法
                                                                  PAGE 胶进行蛋白分离，并转移到 PVDF 膜上，用
                1.1  材料                                           5%脱脂奶粉溶液封闭1.5 h，加入相应抗体4 ℃孵育
                    本研究所用的 6 对 PTC 组织及配对的癌旁正                      过夜。第 2 天使用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 min。
                常组织样本均来自 2022 年 1 月—2023年12月在南                    室温孵育二抗2 h，TBST清洗膜3次，每次10 min，最
                京医科大学第一附属医院因 PTC 而手术的患者。                          后曝光。
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