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第44卷第8期
               ·1064 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年8月


              1.2.7  细胞迁移和侵袭实验                                  计学分析，所有数据用均数±标准差（x ± s）表示，两
                  将肝癌细胞转染24 h后消化，用不含胎牛血清                        组间差异比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素
              的 DMEM 培养基重悬，细胞计数。将 Transwell 小                   方差分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
              室置于 24 孔板中，在小室上方加入 1×10 个细胞，
                                                    6
                                                                2 结     果
              200 μL无血清培养基，小室下方加入500 μL含血清
              的 DMEM 新鲜培养基。1 d 后，取出 Transwell 细胞                2.1  ME3与肝癌预后的相关性分析
              培养器，用棉签轻轻擦掉顶部小室表面细胞，然后                                 TCGA 数据库分析显示 HCC 患者肿瘤组织中
              使用4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液洗净后涂上                       ME3 的 表 达 较 癌 旁 正 常 组 织 显 著 上 调（图 1A，
              结晶紫染色 30 min，PBS 溶液清洗后拍照并计数。                      P < 0.001）。通过 GEPIA 数据库分析 HCC 组织中
              侵袭实验中，将 Transwell 小室更换为含 BD 凝胶的                   ME3 mRNA 表达量与 HCC 患者生存率的关系，结
              小室，其他步骤与细胞迁移实验相同。                                 果显示与 ME3 mRNA 低表达患者相比，高表达患

              1.3  统计学方法                                        者预后相对较差，但差异无统计学意义（图 1B，
                  使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8软件进行统             P > 0.05）。


                         A   10                                     B   100            ME3 Low（n=181）
                                                                                       ME3 High（n=181）
                                           ***                                           Log⁃rank P=0.1
                              8                                         （%） 80
                            mRNA level  6                                60



                            ME3  4                                      Survival rate  40
                              2                                          20
                              0                                           0
                                   Non⁃tumor     Tumor                     0   20  40  60  80  100 120
                                   （n=50）       （n=371）                         Survival time（months）

                 A：Comparison of ME3 levels between tumor tissues and adjacent normal tissues of HCC patients in TCGA database. B：Analysis of the correlation
                                                                  ***
              between ME3 expression and the prognosis of HCC patients by the GEPIA database. P < 0.001.
                                           图1 HCC患者中ME3的表达及其对预后的影响
                                  Figure 1 Expression of ME3 in HCC patients and its effect on prognosis


              2.2  ME3在肝癌细胞株中的表达及质粒sh⁃ME3和                      也表明下调 ME3 可以减弱肝癌细胞的迁移及侵袭
              Flag⁃ME3的效果验证                                     能力（图3C）。这表明，敲低ME3的表达能够抑制肝
                  对人正常肝细胞LO2以及HCC细胞系Bel⁃7402、                   癌细胞的增长、迁移和侵袭能力。
              SMMC⁃7721、HepG2 中 ME3 的 mRNA 和蛋白表达进               2.4  上调 ME3 的表达增强 HCC 细胞增殖、迁移与
              行检测。结果表明，与 LO2 细胞相比，HCC 细胞                        侵袭能力
              系 Bel⁃7402、SMMC⁃7721、HepG2 中 ME3 表达较高                  在 SMMC⁃7721 中转染 Flag⁃ME3 过表达质粒，
             （图 2A、B）。在相对高表达ME3的HepG2中转染干                       CCK⁃8 实验的数据显示 ME3 过表达的 SMMC⁃7721
              扰质粒 sh⁃ME3，MEG3 的 mRNA 和蛋白表达均显                    细胞的增殖活性提高（图4A），平板克隆实验证明过
              著降低（P < 0.01），验证了干扰效率（图 2C）。在                     表达 ME3 的细胞克隆形成能力增强（图 4B）。与此
              相对低表达 ME3 的 SMMC⁃7721 中转染过表达质                     同时，Transwell 和侵袭实验表明上调ME3可以促进
              粒 Flag⁃ME3，其过表达效果同样得到证实（图2D）。                     HCC细胞的迁移及侵袭（图4C）。因此，过表达ME3

              2.3  干扰ME3的表达下调肝癌细胞增殖、迁移与侵                        可以增强HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力。
              袭能力                                               2.5  ME3在HCC细胞中通过活化PI3K/AKT通路发
                  在HepG2中转染sh⁃ME3干扰质粒，CCK⁃8实验                   挥促癌基因作用
              结果表明，敲低ME3的HepG2细胞增殖活性受到抑                              为深入探究ME3增强HCC细胞增殖、迁移及侵
              制（图3A），平板克隆实验表明敲低ME3的细胞克隆                         袭能力可能的分子机制，检测上调或下调 ME3 对
              形成能力下降（图3B）。同时，Transwell和侵袭实验                     PI3K/AKT 通路的影响。结果表明，敲低 ME3 后，
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