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第44卷第8期           何俊波，袁一铭，罗振国，等. ME3对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究［J］.
                  2024年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（8）：1062-1068                      ·1063 ·


                殊症状，治疗效果差，5 年生存率低，已成为全球严                          1.2.2  细胞培养与转染
                重的健康负担 。因此，从分子水平研究 HCC 的发                             细胞培养于 37 ℃、含有 5% CO2、95%湿度的培
                            ［2］
                病机理，寻找重要的作用分子，阐明 HCC 发生与发                         养 箱 内 ，用 含 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM 培 养 基 培
                展的机制迫在眉睫。                                         养。干扰质粒 sh⁃ME3 及过表达质粒 Flag⁃ME3 均
                    肿瘤细胞的生长和转移过程中常伴随着细胞                           由本实验室构建，对照质粒分别为 sh⁃EGFP 和
                能量代谢重编程，其中有氧糖酵解是重要途径之                             Vector。将正处在对数增长阶段的肝癌细胞种植
                一 ［3-4］ 。苹果酸酶（malic enzyme，ME）是一类催化苹              在 6 孔板上，接种密度为 2×10 个/孔，培养 20 h 后
                                                                                              5
                果酸氧化脱羧为丙酮酸和二氧化碳的氧化脱羧酶，                            根据 Lipo⁃fectamine 2000 说明书进行细胞转染，转

                能够调控烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide                     染 6 h 后，更换 DMEM 培养基，继续培养 48 h，收集
                adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的生成从而        细胞进行后续实验。
                影响肿瘤细胞的糖酵解过程              ［5-6］ 。ME3 是 ME 家族      1.2.3  实 时 荧 光 定 量 PCR（quantitative real time
                成员之一，在人体不同肿瘤中的表达和作用机制                             polymerase chain reaction，RT⁃qPCR）
                已被逐渐研究报道，如 ME3 在胰腺癌组织中高表                              Trizol 试剂使用指南步骤，实施使用 Trizol 试剂
                达，且与患者的不良预后呈正相关，其可能通过激                            提取细胞 RNA，随后将 RNA 反转录成 cDNA。采用
                活 TGF⁃β/Smad 信号通路促进胰腺癌细胞上皮间质                      RT⁃qPCR法，以β⁃actin为内参检测ME3的mRNA水
                转化 。此外，ME3 能促进脑神经胶质瘤增殖、迁                          平。ME3 上游引物序列：5′⁃CTTGGTTTCGCTTT⁃
                    ［7］
                移、侵袭和间质转换等恶性行为                 ［8］ 。然而，关于         GCCTGG ⁃ 3′ ，下 游 引 物 序 列 ：5′ ⁃ CAGGT⁃
                ME3 对肝癌细胞的生物学功能及其分子调控机制                           GCTCCCAAAGGGTTA⁃3′；β⁃actin上游引物序列：5′⁃
                尚不明确。本研究通过生物信息学分析 ME3 在                           AGATGTGATCAGCAAGCAG⁃3′，下游引物序列：5′⁃
                HCC 组织中的表达及与 HCC 患者预后的关系。随                        GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA⁃3′。
                后，采用 CCK⁃8、平板克隆形成、Transwell 及侵袭实                  1.2.4  蛋白免疫印迹实验（Western blot）
                验、Western blot 方法检测 ME3 对 HCC 细胞增殖、迁                  HCC细胞转染48 h后，收集细胞并裂解提取蛋
                移和侵袭的影响及其可能机制。                                    白。100 ℃煮沸 10 min 后，12 000 r/min 离心 5 min
                                                                  收取上清。10%的 SDS⁃PAGE 电泳分离蛋白质，并
                1 材料和方法
                                                                  以 300 mA 的电流转到 PVDF 膜。5%的脱脂牛奶常
                1.1  材料                                           温封闭 1 h。一抗孵育 4 ℃过夜，TBST 洗膜 3 次，每
                    正 常 肝 细 胞 系 LO2 以 及 3 种 HCC 细 胞 系             次 10 min。二抗常温孵育 1 h，TBST 再次洗膜 3 次，
                HepG2、BEL⁃7402及SMMC⁃7721购于上海中国科学                  每次 10 min。采用 ECL 化学发光法曝光，检测目的
                院细胞库。胎牛血清和DMEM 培养基（Gibco 公司，                      条带。
                美国）；PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；转染试剂                    1.2.5  CCK⁃8实验
                Lipo⁃fectamine 2000（Invitrogen 公司，美国）；CCK⁃8           将转染后生长 48 h 的 HCC 细胞用胰酶消化后
                试剂盒（上海翊圣公司）；兔抗人ME3、PI3K、p⁃AKT、                    重新接种至 96 孔板中，接种密度为 2×10 个/孔，分
                                                                                                       3
                AKT抗体（Cell Signaling公司，美国）；鼠抗人β⁃tubulin           为对照组和实验组，每组设置5个复孔，另外设置无
                抗体（Bioworld公司，美国）。                                细胞的空白对照组作为参照。每天向 96 孔板中加

                1.2  方法                                           入CCK⁃8试剂盒；第4天CCK⁃8试剂加入后，将孔板
                1.2.1  数据库分析                                      放入培养箱避光继续孵育1~2 h，随后酶标仪测量各
                    分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，            孔在450 nm波长处的吸光度值，实验重复3次并绘
                TCGA）数据库中 HCC 患者肿瘤组织和癌旁正常组                        制细胞增殖曲线。
                织的ME3表达量差异，并通过基因表达谱数据动态                           1.2.6  平板克隆形成实验
                分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，    HCC 细胞转染 48 h 后种植到 6 孔板上，每孔
                GEPIA）网站分析ME3表达量与HCC患者总体生存                        500个细胞，并分为实验组和对照组。将6孔板置入
                率的关系。根据GEPIA数据库中ME3表达中位数，                         恒温培养箱培养 10~15 d 后，观察细胞克隆，用 4%
                将 HCC 患者分为高表达组和低表达组，进行预后                          多聚甲醛固定细胞后结晶紫染色，PBS 清洗染液后
                研究。                                               常温干燥，拍照统计细胞克隆的数目。
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