Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第12期
·1660 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年12月

成像技术监测植入 GSC 的小鼠脑内的生长情况。 化标志物 GFAP 表达降低（图 1B、C）。通过以上实
动物腹腔注射荧光素钾盐120 mg/kg，异氟醚麻醉后 验获得并验证了配对的DGC和GDC。
进行图像分析。使用 ANIVIS 成像系统捕获肿瘤荧 2.2 外泌体的提取与鉴定
光素酶图像。 按图示流程收集细胞上清中EV（图2A）。透射
1.2.10 免疫组化染色 电镜观察显示，GSC EV和DGC EV呈圆形或椭圆形
对于免疫组织化学研究，将切片分别与 Ki⁃67 囊泡结构，直径约 100 nm，双层膜包被（图 2B）。
和 cleaved caspase3 的一抗（1∶100 稀释）于 4 ℃下孵 Western blot实验结果表明，GSC EV和DGC EV总蛋
育过夜，然后与生物素化的二抗（1∶200 稀释）于室温 白表达外泌体特异标志蛋白 CD9、TSG101（图 2C）。
下孵育1 h，然后用ABC⁃过氧化物酶试剂孵育1 h，用 纳米颗粒跟踪分析发现 GSC EV 和 DGC EV 的粒径

PBS 洗涤，用 3，3⁃二氨基联苯胺（30 mg 溶于 100 mL 和数量没有显著差异（图 2D）。以上实验表明获得
含0.03%H2O2的Tris缓冲液中）染色5 min，用水冲洗 了分别来源于DGC和GDC培养基上清液中的EV。
并用苏木精复染。每个切片随机选择的10个视野， 2.3 GSC EV 对 U87 细胞增殖、侵袭和 TMZ 耐药能
光学显微镜评估Ki⁃67和cleaved caspase3表达。 力的影响

1.3 统计学方法 为研究EV 对胶质瘤细胞恶性生物学行为的调
所有数据均用 GraphPad Prism 8 软件进行分 控作用，使用不同来源外泌体处理 U87 胶质瘤细
析，采用双尾 Student⁃t 检验评估差异的显著性。生 胞。通过 CCK8 实验检测发现，相比 DGC 来源的
存分析采用 Kaplan⁃Meier 法。P < 0.05 为差异有统 EV，GSC 来源的 EV 可显著增加 U87 细胞增殖能力
计学意义。 （图 3A）。克隆形成实验结果也提示，GSC EV 能使
U87 细胞克隆形成显著增多（图 3B）。Transwell 侵
2 结 果
袭实验表明，经过 GSC EV 刺激后的 U87 细胞具有
2.1 配对GSC和DGC的获取与验证 更强的侵袭能力，差异有统计学意义（图3C）。另外
通过含有10%FBS的DMEM培养基对原代GSC GSC EV 刺激后的 U87 细胞，在 TMZ 处理的情况下，
进行分化，成功获得了1对相匹配的GSC和DGC（图 其细胞活力相比 DSC EV 刺激后的 U87 细胞更强，
1A）。Western blot 和 qRT⁃PCR 分析检测胶质瘤干 说明 GSC EV 刺激后的U87细胞获得了更高的TMZ
细胞特异标志物的表达。相较于 DGC，GSC 的干细 耐药能力（图3D）。以上实验说明，GSC来源的EV可
胞特异标志 SOX2、Olig2 和 c⁃Myc 的表达升高，而分 显著提高胶质瘤细胞增殖、侵袭和TMZ耐药能力。

A B
DGC GSC DGC GSC
SOX2 35 kDa
Olig2 35 kDa
GFAP 50 kDa
c⁃Myc 60 kDa
GAPDH 37 kDa
200 μm
C 15 ** 15 ** 1.5 20
mRNA相对表达量 10 mRNA相对表达量 10 GFAP mRNA相对表达量 1.0 c⁃Myc mRNA相对表达量 15 **

10

SOX2 5 0 Olig2 5 0 0.5 ** 5 0
0.0
DGC GSC DGC GSC DGC GSC DGC GSC
A：细胞成球实验检测胶质瘤干细胞成球能力；B：免疫印迹实验检测胶质瘤干细胞的干性标志物和分化肿瘤细胞的分化标志物；C：qRT⁃
PCR实验检测胶质瘤干细胞的干性标志物和分化肿瘤细胞的分化标志物。与DGC比较，P＜0.01。
**
图1 人脑胶质瘤干细胞的分化与鉴定
Figure 1 Differentiation and identification of human glioblastoma stem cells