Page 23 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第12期 高健成，陆晨飞，张梓枫，等. 胶质瘤干细胞来源的外泌体促进胶质瘤恶性进展［J］.
2022年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（12）：1658-1663 ·1659 ·

cellular vesicle，EV）是细胞在生理、病理条件下释放 察U87细胞增殖、侵袭和TMZ耐药能力的差异。
到胞外的一种双层膜囊泡，能与相应靶细胞受体结 1.2.3 RNA提取及qRT⁃PCR
合或转移外泌体内含物进而发挥生物学功能 。研 采用 TRIZOL 试剂从细胞中提取总 RNA。用
［5］
究表明，肿瘤细胞分泌的 EV 能通过不同机制影响 PrimeScript RT 试剂盒合成 cDNA。用 SYBR Green
［6］
肿瘤的侵袭、转移、血管生成等 。为此，本研究拟 PreMix Ex Taq 进行实时定量 PCR（qRT⁃PCR）分析。
采用体外、体内实验，探讨GSC来源的EV对胶质瘤 总RNA水平用18s归一化。各基因的相对定量取值
细胞增殖、侵袭和替莫唑胺（temozolomide，TMZ）耐 为2 -ΔΔCT 。
药能力的影响。 1.2.4 蛋白质提取及Western blot分析
细胞在添加蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂
1 材料和方法
解30 min。裂解产物4 ℃下14 000 g离心15 min，收
1.1 材料 集上清液，用BCA法测定蛋白质浓度。每个槽口取
人胶质母细胞瘤细胞U87购买自美国模式培养 20 μg 蛋白上样，10% SDS⁃PAGE 凝胶电泳分离蛋
物集存库（ATCC）。人胶质母细胞瘤干细胞来自南 白，湿转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，４℃一
京医科大学汪秀星实验室。 抗孵育过夜，常温二抗孵育2 h，曝光显影。
B27、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神 1.2.5 CCK8检测
经基础培养液（赛默飞世尔科技公司，美国）；胎牛 各处理组的 U87 细胞消化后重悬于培养液中，
血清（Hyclone公司，美国）；人SOX2抗体、人Olig2抗 每孔 1×10 个细胞接种于 96 孔培养板中，37 ℃、5%
4
体、人 c⁃MYC 抗体、人 CD9 抗体、人 TSG101 抗体 CO2继续培养。分别于处理后24、48、72 h检测。检
（CST公司，美国）；人GAPDH抗体（上海碧云天生物 测前 4 h 每孔加入 5 μL CCK8 溶液，用酶标仪测定
公司）；羊抗兔、鼠 IgG⁃HRP 二抗（合肥 Biosharp 公 各孔的吸光度值，波长为450 nm，取平均值。
司）。人 Ki⁃67、人 Cleavedcaspase3 抗体（武汉 Pro⁃ 1.2.6 克隆形成实验
teintech 公司）。ExosupurTM 外泌体分离纯化试剂 取对数生长期细胞，以500个/孔密度接种到6孔
盒（武汉 ABclonal 公司）。蛋白酶抑制剂、蛋白裂解 板中。24 h 后待细胞贴壁后换液，并分别给以 GSC
缓冲液 RIPA（上海碧云天生物公司）。TRIZOL 试 EV和DGC EV处理，静置生长10 d后终止培养。用
剂、PrimeScript RT 试剂盒（北京宝日生物公司）。 PBS缓慢清洗2遍后加甲醇置-20 ℃冰箱固定6 min，
CCK8（南京诺唯赞生物公司）。姬姆萨染液、荧光素 加 0.1%结晶紫染色 30 min，吸去染色液，PBS 漂洗
钾盐（上海翌圣公司）。 2 次，风干拍照。
1.2 方法 1.2.7 Transwell侵袭实验
1.2.1 细胞培养 将不同处理后的 U87 细胞，消化后用培养基吹
原代 GSC 培养于添加了 B27、表皮生长因子和 打成为细胞悬液，将小室放入 24 孔板，取 200 μL
成纤维细胞生长因子的神经基础培养液中。为了 （3×10 个/mL）细胞悬液置于上室，下室为 500 μL的
4
获得分化肿瘤细胞（differentiated glioma cell，DGC）， 新生牛血清，24 h 后取出培养板，弃培养基，PBS 洗
将 GSC 培养于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中 3次，甲醇固定15 min，PBS洗3次，姬姆萨染色45 min，

进行分化，置于37 ℃、5％CO2培养箱中培养，每隔1 d 显微镜拍照统计。
换液，分化7 d。胶质瘤U87细胞培养于添加了10% 1.2.8 动物研究
胎牛血清的 DMEM 培养基中，置于 37 ℃、5％CO2培 雄性裸鼠（nu/nu）购自北京 Vital River Animal
养箱中培养。 Center，饲养在无特殊病原体（SPF）条件下。为了评
1.2.2 外泌体分离与实验分组 估化疗耐药性，原位成瘤1周后，小鼠每天腹腔注射

DGC和GSC培养48 h，收集培养基上清，在4 ℃ 20 mg/kg浓度的TMZ。所有动物操作均按照南京医
条件下，3 000 g离心10 min。1 mL上清加250 μL外 科大学伦理指导原则进行。
泌体分离试剂，混匀，4 ℃静置2 h。混匀液在4 ℃条 1.2.9 颅内原位成瘤和活体成像
［7］
件下，120 000 g离心20 min。将EV颗粒悬浮于PBS 根据文献报道，构建小鼠原位成瘤模型 。为
中进一步实验或在-80 ℃下保存。不同来源的 EV 监测活体动物的肿瘤生长，使用带荧火虫荧光素酶
分别加入细胞培养基（30 μg/mL），刺激U87细胞，观 的慢病毒感染 U87 细胞（MOI=0.8）。通过生物发光