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第42卷第12期 朱晓文，岳 磊，赵文虎，等. 微生物通过巨噬细胞RIG⁃I乳酸化修饰促进结直肠癌肝转移的
2022年12月 机制研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（12）：1664-1672 ·1667 ·

再加入0.3%Triton通透10 min，PBS冲洗后血清封闭 CRLM发展，在CRLM模型中将Clod⁃Lip注射到小鼠
30 min，再次 PBS 冲洗。与一抗 4 ℃孵育过夜，PBS 体内，其可被巨噬细胞吞噬，在细胞内代谢成不可
冲洗 3 次；与二抗室温孵育 2 h，PBS 冲洗 3 次；DAPI 水解的ATP类似物，抑制线粒体中的ADP/ATP转运
染核后行荧光检测。 机制，阻断线粒体呼吸链诱导巨噬细胞凋亡（图
1.2.11 qPCR检测 2A），结果显示耗竭巨噬细胞后肝转移瘤体积相较
收集经处理的各组细胞，提取RNA，使用Nano⁃ E.coli 组显著减小（图 2B），说明微生物通过调控巨
Drop检测RNA的浓度及纯度。将其逆转录为cDNA 噬细胞来影响CRLM。
后，按照纯水：SYBR mix：前引物：后引物：cDNA= 2.3 微生物影响肿瘤细胞糖酵解水平促进结直肠
3.6∶5.0∶0.2∶0.2∶1.0比例避光配置q⁃PCR体系（10 μL）， 癌肝转移
行qPCR检测。反应结束后，拷贝数据进行后续分析。 为了探究微生物对肿瘤细胞的影响，将 E.coli
1.2.12 Western blot实验 与肠癌细胞MC38共培养，发现与对照组相比，E.coli
收集经处理的各组细胞，加入 RIPA 裂解液提 处理后MC38的增殖率变化无明显差异（P=0.795），

取总蛋白，BCA法进行定量。取等量蛋白进行SDS⁃ 但其细胞外酸化率值及 Lac 水平显著高于 Con 组
聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉溶液封闭 （图3A）。LDHi可抑制糖酵解过程中限速反应的关
1 h，加入一抗NF⁃κB（1∶1 000），于4 ℃孵育过夜，清 键分子乳酸脱氢酶（LDH），使丙酮酸不能转化为
洗后加入HRP标记的兔二抗（1∶200）室温孵育2 h， Lac。用 LDHi 进行体内实验，结果显示抑制 LDH
清洗后加入ECL发光剂于暗室中显影、曝光。 后，肿瘤内Lac水平及肝转移瘤体积均低于E.coli组
1.3 统计学方法 （图3B）,提示微生物通过提高肿瘤细胞的糖酵解及
实验数据用均值±标准误（x ± Sx ）表示。两组间 Lac水平来影响CRLM。
比较用t检验，多组比较先用单因素方差分析（ANO⁃ 2.4 Lac 通过 RIG⁃I lys852 乳酸化修饰促进巨噬细胞
VA），后用LSD法进行两两比较。P＜0.05为差异有 M2 极化并降低线粒体抗病毒信号蛋白（mitochon⁃
统计学意义。 drial antiviral signaling protein，MAVS）及其下游 NF⁃
κB活化
2 结 果
为了探讨 Lac 对巨噬细胞是否有调控作用，用
2.1 微生物促进结直肠癌肝转移 15 mmol/L Lac 处理小鼠 BMDM，免疫荧光检测发现
群落 Bar 图显示 CRLM 患者的肝肿瘤与结肠肿 Lac组CD206表达增多，iNOS表达减少（图4A）；qPCR
瘤样本中存在微生物，同一个患者中肝转移瘤和结 显示 Lac 组 CD163 和 ARG 的 mRNA 转录水平显著
肠肿瘤菌群相似，但不同患者之间菌群丰度存在差 高，iNOS 和 CD86 的 mRNA 转录水平显著降低（图
异（图1A），提示微生物可能参与CRLM的发展。建 4B），说明 Lac 可直接促进巨噬细胞极化为 M2 细
立小鼠 CRLM 模型，分别用抗生素（抑制菌群生长） 胞。Western blot检测显示不同浓度的Lac刺激巨噬
和E.coli（加重菌群负荷）处理。相较于Con组，E.coli 细胞后，蛋白的泛乳酸化水平上升，其上升程度与
组肝转移瘤明显增多，体积增大，瘤内微生物浓度 Lac 浓度成正比，存在剂量依耐性（图 4C）。将其与
升高，HE染色显示肿瘤细胞失去正常肝小叶结构， Lac、巨噬细胞共培养 24 h，免疫荧光检测显示相较
异型性更加明显，细胞形态紊乱，核深染。而抗生 于 Lac 组，RIG⁃I lys852 Ab 处理后巨噬细胞的 CD206 表
素处理后的 Abx 组肝转移瘤明显少于 Con 组，体积 达降低，iNOS表达升高；而HMGB1 lys88 ，HMGB1 lys114 处
明显减少（图 1B~D），提示微生物促进 CRLM 的发 理后巨噬细胞CD206及iNOS表达均比Con组高（图
展。由于肝内存在大量巨噬细胞，其极化为 M2 可 4D），提示RIG⁃I lys852 是决定巨噬细胞极化方向的乳酸
促进肿瘤增殖转移 ［12］ ，本研究运用免疫荧光染色分 化修饰位点。为了探讨视黄酸诱导基因I（RIG⁃I）的
析了肿瘤内巨噬细胞的极化情况，发现 E.coli 组中 乳酸化修饰是否影响下游通路，运用分子模拟预测发
CD206 表达相较于 Con 组明显增强，而 Abx 组表达 现RIG⁃I的乳酸化修饰可导致原阳离子⁃π（CATION⁃

减弱（图 1E），提示微生物促进肿瘤内巨噬细胞 M2 PI）键的丢失，降低了 MAVS 的活化（图 4E）；West⁃
极化。 ern blot 显示RIG⁃I⁃MAVS 下游核因子κB（NF⁃κB）在
2.2 微生物通过影响巨噬细胞促进结直肠癌肝转移 Lac 处理巨噬细胞后表达明显减弱（图 4F），提示
为了验证微生物是否通过巨噬细胞来影响 RIG⁃I 的乳酸化修饰可降低 NF⁃κB 的表达。用 NF⁃