Page 30 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第12期
               ·1666 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年12月


              天生物公司）；Lac 测定试剂盒（南京建成公司）；                         3.7 mg/mL）；④ HMGB1     lys88 Ab 组（15 mmol/L Lac +
                                                                       lys88                          lys114 Ab 组
              BCA 蛋白定量试剂盒（Biosharp 公司，中国）；NF⁃κB                 HMGB1    Ab 3.8 mg/mL） ；⑤ HMGB1
             （AF5006）兔单抗、羊抗兔多克隆 IgG（#S0001）（Af⁃                 （15 mmol/L Lac+HMGB1   lys114 Ab 1.6 mg/mL）；⑥TNF⁃
              finity Biosciences公司，美国）。                         α组（15 mmol/L Lac +50 ng/mL TNF⁃α）。置于37 ℃、
              1.2  方法                                           5%CO2培养箱内培养 24 h 后收集细胞蛋白或 RNA
              1.2.1 16S rDNA测序                                  进行下一步实验。
                  取 40~70 mg 肿瘤组织，CTAB 法提取总 DNA 后               1.2.4 细菌感染MC38细胞模型

              用 Qubit 检查基因组 DNA 的质量和浓度。对 16 S                        用RPMI完全培养基培养MC38细胞，根据细胞
              rRNA 基因的可变区 V2、V3、V5、V6、V8 进行多重扩                  数量，调整细菌与MC38细胞之比为感染复数=100∶
              增，在 Illumina Novaseq 6000 平台进行测序，最后使              1，在 37 ℃、5%CO2培养箱内，E.coli 与 MC38 细胞共
              用QIME软件处理测序数据。                                    培养。
              1.2.2 小鼠CRLM模型建立及分组                               1.2.5 CCK8实验
                  取 6~8 周雄性 C57BL/6 小鼠，麻醉后行左上腹                       将MC38细胞接种于96孔板上，每孔加入100 μL
              横行切口，打开腹腔，于腹外侧游离并显露脾脏，                            细胞悬液（细胞数约 5×10 个）。按上述建立 E.coli
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              用 1 mL 注射器从脾下极平行进针约 3 mm，注入                       感染 MC38 细胞共培养模型为实验组，以无细菌感
              MC38 肿瘤细胞悬液至脾被膜下，肿瘤细胞悬液浓                          染 MC38 细胞为对照组，每组设立 5 个复孔，每孔加
              度为 1×10 个/mL，每只注入 0.1 mL，见注射部位脾                   入 10 μL CCK8 检测液，孵育 2 h，酶标仪在 450 nm
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              被膜发白肿胀后拔出针头，压迫止血 2 min，逐层关                        处检测吸光值。
              腹。共分为 5 组：①对照组（Con 组）；②抗生素组                       1.2.6  细胞外酸化率（extracellular acidification rate，
             （Abx组）：将抗生素复合物（氨苄青霉素 1 g/L，万古                      ECAR）
              霉素 500 mg/L，新霉素 1 g/L，甲硝唑1 g/L）放入小鼠                    将上述共培养细胞制成细胞悬液，每孔接种80
              饮用水中混匀，持续饮用至建模结束；③E.coli组：建                       μL（细胞数约1×10 个）至Seahorse专用96孔板。室
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              模第11~15天抗生素处理（同上）后，第19~21天E.coli                  温静置1 h，放入培养箱继续培养23 h。分别向探针
             （1×10 CFU/mL）100 μL 灌胃；LDHi 组：④第 7 天开              板 A、B 和 C 孔加入葡萄糖、寡霉素和 2⁃脱氧核糖各
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              始按照 6 mg/kg 予以灌胃，持续至建模结束；⑤                        25 μL，校正探针板后，加入细胞培养板检测。
              Clod⁃Lip4组：建模前1 d腹腔注射200 μL，后间隔3 d                1.2.7 Lac浓度的测定
              给药，直至建模结束。第 24 天处死小鼠，收集肝脏                              将肿瘤组织制备成组织匀浆，按照说明书配置
              组织，每个实验组的样本量为 5。计算肝表面转移                           酶工作液、显色剂。依次在酶标板上加入样本、酶
              结节体积［用直尺测量肿瘤的长径和短径（cm），代入                         工作液、显色剂，37 ℃孵育10 min，随后加入终止剂
              公式计算肿瘤体积：V（cm）=0.5×长径×短径 ］，并将                     终止反应。取反应液 250 μL，设置酶标仪波长
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              转移肝组织做病理切片及HE染色。                                  530 nm，读数。
              1.2.3  骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derived mac⁃          1.2.8 组织病理学分析
              rophages，BMDM）培养及分组                                    切除肝脏组织后，将其固定在10％的福尔马林
                  脱颈处死小鼠，分离股骨和胫骨。剥除骨骼上附                         缓冲液中，随后包埋在石蜡中。肝肿瘤组织切片用
              着组织，用DMEM完全培养基将骨髓冲入50 mL离心                        HE染色。
              管，1 250 r/min，离心5 min。加入红细胞裂解液混匀，                 1.2.9 免疫荧光检测CD206、iNOS的表达
              再次离心，加入含有M⁃CSF的DMEM完全培养液，以                             肝脏肿瘤标本石蜡切片脱蜡、抗原修复、血清
              1×10 个/mL 密度铺在 6 孔板上，添加培养基，置于                     封闭后，与一抗4 ℃孵育过夜，再加对应的HRP标记
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              37 ℃、5%CO2培养箱内培养，第4天换液，第7天观察                      的二抗室温孵育50 min。PBS洗涤3次后滴加TSA，

              细胞形态及贴壁情况。根据已发表文献结合 String                        避光室温孵育10 min，TBST洗涤3次。滴加DAPI复
              数据库查找与巨噬细胞有关的乳酸化位点并定制抗                            染，封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

              体RIG⁃I lys 852 Ab、HMGB1 lys88 Ab和HMGB1 lys114 Ab。处理  1.2.10 细胞免疫荧光检测
              分为6组：①对照组（Con）；②乳酸组（15 mmol/L Lac）；                    将细胞悬液接种的 6 孔板中，培养过夜后用
              ③ RIG ⁃ I lys852 Ab 组（15 mmol/L Lac + RIG ⁃ I lys852 Ab  PBS 冲洗 2 次，加入 4%多聚甲醛溶液固定 15 min。
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