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第42卷第12期
               ·1674 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年12月


              疗仅适用于早期CCA 患者，其复发风险高。中晚期                          库 GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。 从 数
              CCA 患者中位生存时间少于 2 年，5 年生存率仅为                       据库中检索关于人 CCA 相关的数据集，经过筛
              10％ ［3，6］ 。寻找影响CCA发生和进展的基因驱动因素                    选，选择了 3 个基因表达谱（GSE32879、GSE45001
                                                      ［1］
              对于探索分子诊断和靶向治疗具有重要意义 。近                            和 GSE76297），其中 GSE32879 和 GSE76297 分别来
              年来，生物标志物研究在CCA的预测、治疗和预后方                          自Affymetrix 的GPL6244和GPL14550，GSE45001来
                          ［7］
              面取得了进展 。例如，在pCCA和dCCA中已鉴定出                        自Agilent的GPL14550（表1）。
              KRAS突变和PRKACB 融合基因，在iCCA中已鉴定
                                                                         表1 CCA基因芯片数据集基本信息
                                                 ［8］
              出异柠檬酸脱氢酶（IDH）的体细胞突变 。此外，诱                          Table 1 Basic information of gene chip data sets for CCA
              导型一氧化氮合酶（iNOS）通过炎症依赖性方式参与                                                                  （n）
              CCA的发生。然而，由于遗传异质性强，目前对CCA                            数据集      CCA组织     正常组织      合计      来源
              分子机制的认识尚不全面，对促进CCA启动和发展                             GSE32879     16       07      023   GPL6244
              的遗传变异的理解仍然是片面的。此外，致癌的关键                             GSE45001     10       10      020   GPL14550
              驱动基因仍然未知 。因此，研究CCA的发病机制并                            GSE76297     91       92      183   GPL17586
                              ［4，9］
              确定参与CCA发展的枢纽基因仍然是一项重大挑战。                          1.2  方法
                  基因综合表达数据库（gene expression omnibus，            1.2.1  差异表达基因（differentially expressed gene，
              GEO）是一个公共基因表达库，包含超过 94 000 个                      DEG）的获取
              数据集和超过 200 万个样本           ［10］ 。这是一个丰富的                使用在线分析工具 GEO2R（https：//www.ncbi.
              资源库，通过适当的方法和工具，可用于整合基因                            nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析上述 3 个数据集中 CCA
              表达数据，用于生物标志物发现               ［11］ 、疾病分类或表         样 本 和 正 常 样 本 之 间 的 DEG，以 P < 0.05 且
              型比较   ［12］ 等。癌症基因组图谱（TCGA）是一项公共                   |log2FC ≥1|的基因被认为是DEG。
              资助项目，主要目的在于对30多个人类癌症的大型                           1.2.2 差异基因的火山图和韦恩图的绘制
              队列中的主要致癌基因组改变进行研究。有许多                                  在线分析使用韦恩图网络工具（bioinformatics.
              基于 TCGA 的CCA肿瘤学研究          ［15-16］ ，如Wang等 ［17］ 研  psb.ugent.be/webtools/Venn/）对3个数据集的DEG取
              究了 lncRNA⁃miRNA⁃mRNAceRNA 网络，并确定了                 交集而获得共有差异基因。
              3 种 lncRNA，即 COL18A1 ⁃ AS1、SLC6A1 ⁃ AS1 和         1.2.3 DEG的GO和KEGG通路分析
              HULC与CCA 患者的总体存活率显著相关。为了对                              GO 分析是功能富集研究的常用方法之一；
              癌症基因组图谱进行综合分析，在 TCGA 中应用了                         KEGG 是一个被广泛使用的数据库，它存储了大量
              依赖于使用微阵列和下一代测序方法的高通量技                             关于基因组、信号通路、疾病模型和药物等的数
              术 ［13］ 。RNA 测序（RNAseq）已成为转录组（总RNA）                据。本研究中DEG的GO注释富集分析和KEGG通
              分析和获取准确链信息的有用工具                 ［14］ 。RNAseq 是    路富集分析是通过 DAVID 数据库工具（https：//da⁃
              一种有利于对差异表达基因相互作用和相关信号                             vid.ncifcrf.gov/）进行的。P < 0.01和计数≥10认为具
              通路进行高精度系统综合研究的方法。此外，蛋白                            有统计学意义。
              质⁃蛋白质相互作用网络（protein⁃protein interaction，          1.2.4 蛋白互作网络和枢纽基因的构建
              PPI）可用于区分中枢基因，这些基因被定义为具有                               使 用 检 索 相 互 作 用 基 因（STRING）数 据 库
              高度连接性的基因，在稳定 PPI 网络结构方面发挥                         （http：//string⁃db.org/）进行PPI 分析。随后，使用Cy⁃
              重要作用。                                             toscape软件（www.cytoscape.org/）对PPI进行可视化，
                  本研究旨在通过运用生物信息学方法分析                            并构建枢纽基因模块。在本研究中，前10个基因被
              GEO数据库中基因芯片数据集，发掘CCA的核心基                          确定为枢纽基因。
              因，为探索CCA的发病机制和潜在治疗靶点提供一                           1.2.5 枢纽基因的表达验证及生存分析
              定的理论依据。                                                运用 GEPIA（http：//gepia.cancer⁃pku.cn /）对枢
                                                                纽基因进行表达水平和生存分析。
              1  资料和方法
                                                                1.2.6 枢纽基因的表达验证
              1.1  资料                                                通 过 RT ⁃ PCR 和 Western blot 检 测 枢 纽 基 因
                  本研究所使用的基因数据来自基因表达数据                           SLC2A2在CCA及正常胆管细胞的表达量（SLC2A2⁃
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