Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 9

第42卷第12期       董汇昱，周天任，赵旭嵩，等. 奥拉帕利联合恩杂鲁胺协同抑制前列腺癌细胞生长的机制研究［J］.
                 2022年12月                  南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（12）：1643-1650，1672                   ·1645 ·


                的密度接种于 96 孔板中，待细胞贴壁后分别加入                          续孵育 2 h。使用裂解缓冲液洗涤 5 次后，使用 2×
                OLA及ENZ。加入药物48 h后利用CCK⁃8测得细胞                      SDS⁃PAGE 上样缓冲液洗脱免疫复合物并进行
                的数量，继而计算出不同浓度药物对细胞的抑制率，                           Western blot实验。
                最终通过回归分析计算出不同药物对应细胞的IC50。                         1.2.7  总 RNA 提 取 和 定 量 实 时 聚 合 酶 链 反 应
                    得到不同药物对应的 IC50后，分别用单药 0.25、                  （quantitative real time polymerase chain reaction，
                0.50、1.00、2.00、4.00倍的IC50作用于细胞，再同时联               qRT⁃PCR）
                用两药 0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 倍的 IC50 浓           使用 TRIzol 从细胞系中提总 RNA。使用逆转
                度共同作用于细胞。利用CCK⁃8测得细胞的数量，                          录试剂PrimeScript RT Master Mix将提取的总RNA
                                                                                  TM
                而后通过CompuSyn软件计算CI值           ［14］ 。CI值>1表示       逆转录成cDNA。使用染料法定量PCR试剂盒进行
                两药之间为拮抗作用，CI值=1表示两药之间为叠加                          qRT⁃PCR。用于 mRNA 检测的反应条件如下：95 ℃
                作用，CI值<1表明两药之间为协同作用且CI值越小                         30 s；40个循环的95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s。所有反应独立
                则表示两药协同作用越强。                                      重复 3 次。使用针对β⁃actin 的相对定量方法（2               -ΔΔCt
                1.2.3 细胞增殖实验                                      法）测算各个基因之mRNA 的表达水平。引物设计
                    使用 CCK⁃8 评估细胞增殖数量。取对数生长                       如下：肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），正
                期的C4⁃2细胞，以1 000个/孔细胞的密度接种于96孔                     向 5′⁃CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG⁃ 3′，反向 5′⁃
                板中。待细胞贴壁后分别加入DMSO、ENZ、OLA 以                       GAGGACCTGGGAGTAGATGAG⁃3′；肿瘤坏死因子α
                及 ENA+OLA。分别在接种细胞 24、48、72、96 h 后                 诱导蛋白 2（tumor necrosis factor alpha⁃induced pro⁃
                以 10%的浓度加入 CCK8，通过酶标仪读取 450 nm                    tein 2，TNFAIP2），正 向 5′ ⁃ CCCCAATGACATCAT⁃
                的吸光度值来计算细胞的增殖水平。                                  CAACA⁃3′，反向 5′⁃GCCTCACTGGACAGGAATGT⁃
                1.2.4 细胞克隆实验                                      3′ ；TNFAIP8，正 向 5′ ⁃ ATAGACGACACAAGTAGT⁃
                    将 200 个 C4⁃2 细胞接种于 6 孔板中培养 24 h，              GAGGT⁃3′，反向5′⁃CCACGGTCATAGCAAGCTGAT⁃
                然后分别在其中加入 DMSO、ENZ、OLA 以及 ENZ+                    3′；肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样蛋白1（tumor necro⁃
                OLA。含有培养液的药物每 5 d 更换 1 次，在培养                      sis factor alpha⁃induced protein 8⁃like protein 1，TN⁃
                10 d 后使用甲醇固定 20 min 后用 0.1%结晶紫染色                  FAIP8L1），正向 5′⁃AAGAAGCTCCTGAGTAAGATG⁃
                20 min。                                           GC⁃3′，反向 5′⁃AGCAGCAGTCCCAGCTTCAG⁃3′；β⁃
                1.2.5 蛋白质提取及蛋白质印迹法（Western blot）                  actin，正 向 5′ ⁃ TGACGGGGTCACCCACACTGT⁃
                    取对数生长期的 1.5×10 个 C4⁃2 细胞接种在                   GCCCATCTA⁃3′，反向：5′⁃CTAGAAGCATTTGCGGT⁃
                                          5
                6 孔板中，待细胞贴壁后分别加入DMSO、ENZ、OLA                      GGACGATGGAGGG⁃3′。
                以及ENA+OLA 后培养48 h。在有磷酸酶抑制剂和                       1.2.8 免疫荧光（immunofluorescence，IF）
                蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液中裂解细胞的总蛋白                              取对数生长期的 2.5×10 万个 C4⁃2 细胞接种于
                                                                                            4
                质。将样品煮沸10 min后，根据不同的目标基因分                         含 爬 片 的 12 孔 板 中 ，待 细 胞 贴 壁 后 分 别 加 入
                子量将蛋白质样品在不同浓度SDS⁃PAGE的凝胶上                         DMSO、OLA、ENZ 和 OLA + ENZ 处理 48 h。PBS 清
                进行电泳。将裂解物转移到PVDF膜上。利用封闭                           洗后固定液固定20 min，洗涤后封闭液于4 ℃封闭过
                液将 PVDF 膜封闭 2 h 以上再使用相应的一抗处理                      夜，吸水纸吸尽后使用一抗4 ℃孵育过夜，之后用二
                过夜，清洗条带后使用相应的二抗孵育，最后再次                            抗避光孵育后将其吸尽，最后用含DAPI的抗荧光淬

                清洗条带后加入曝光液，利用化学发光法及 West⁃                         灭封片液滴于载玻片上，在荧光显微镜下拍取相片。
                ern blot 成像系统检测蛋白质印迹，最后利用 Image                   1.2.9 细胞凋亡检测
                Lab软件进行定量分析。                                          取对数生长期的 1.5×10 万个 C4⁃2 细胞接种在
                                                                                            5
                1.2.6 免疫共沉淀（co⁃immunoprecipitation，Co⁃IP）         6孔板中，待细胞贴壁后分别加入DMSO、OLA、ENZ
                    将裂解缓冲液加入细胞中并在4 ℃孵育40 min以                     和 OLA + ENZ 处理 48 h。利用 Accutase 消化细胞，

                裂解细胞。在4 ℃条件下以13 000 r/min离心15 min                 之后离心机1 000 r/min离心5 min后去除上清液，加
                后吸取每组等量上清液 2 μL 加入一抗或作为阴性                         入 500 μL Apoptosis Positive Control Solution 重悬，冰

                对照的 IgG 于 4 ℃孵育过夜。然后，将 10 μL 50%                  上孵育 30 min 后再洗涤，弃上清后加入 1×Binding
                protein A/G beads 加入免疫复合物中，并在4 ℃下继                Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞
   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14