Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第12期
               ·1646 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年12月


              与之混合。最后加入预冷 1×Binding Buffer 补充至                            1.0
                                                                                                ENZ
              1.5 mL，分成 3 管，一管为空白对照管，两管为单染                                                      OLA
                                                                          0.8
                                                                                                ENZ+OLA
              管。单染管分别加入5 μL Annexin V⁃FITC或10 μL
                                                                          0.6
              PI，室温避光孵育5 min。其余处理组细胞至少收集                                  生长率
              10 万个细胞后再用 Binding Buffer 稀释，每管加入                           0.4
              5 μL Annexin V⁃FITC 和 10 μL PI后避光孵育5 min，                   0.2
              而后上机通过 FITC 检测通道检测 Annexin V⁃FITC                           0.0
                                                                              E:8  E:16  E:32  E:64  E:128
             （Ex=488 nm；Em=530 nm），通过 PI 检测通道（Ex=                             O:16  O:32  O:64  O:128 O:256
              535 nm；Em=615 nm）检测 PI。最后利用Flowjo进行                         2.0
              结果分析。
                                                                          1.5
              1.2.10 二代高通量测序及结果分析
                  取对数生长期的C4⁃2细胞接种于大皿中，待细                                  CI  1.0

              胞贴壁后分别加入 DMSO、ENZ、OLA 及 ENZ + OLA                           0.5
              于大皿内，处理 48 h 后使用 TRIzol 提取 RNA，每个
                                                                          0.0
              处理重复 3 个样，共 12 个样本。利用 Illumina 二代                             0.0          0.5          1.0
                                                                                   Fraction affected（Fa）
              高通量测序平台并采用 PE150 测序策略，利用 Cuf⁃
                                                                 图 1  联合使用 ENZ 和 OLA 在前列腺癌细胞系 C4⁃2 中的
              flinks等软件完成比对和转录本拼接分析，参考基因
                                                                     协同效应
              组为Homo sapiens。计算每千碱基外显子模型每百                       Figure 1  Synergistic effect of combined use of ENZ and
              万映射读数的片段（fragments per kilobase of exon                    OLA in C4⁃2 cell line
              model per million mapped reads，FPKM）以使不同长
              度基因、不同测序数据量的样本间具有可比性。                             物的使用浓度，即ENZ 5 μmol/L、OLA 10 μmol/L。克
              1.3  统计学方法                                        隆形成实验结果显示，在 C4⁃2 中联合使用 ENZ 和
                  利用GraphPad Prism 8进行统计学分析，多组间                 OLA 对比单用 ENZ 和 OLA 有较强的协同作用（图
              比较采用One⁃way ANOVA（单因素方差分析），多组                     2A、B）。利用 CCK⁃8 测定增殖曲线，同样发现联合
              间两两比较采用Tukey’s multiple comparisons test，所        使用 ENZ 和 OLA 对比单药具有更强地抑制细胞生
              有实验重复3次，P＜0.05为差异有统计学意义。                          长的作用（图2C）。
                                                                2.3  联合使用ENZ和OLA促使前列腺癌细胞凋亡
              2  结 果
                                                                     将 C4⁃2 分别予以 DMSO、ENZ、OLA 以及 ENZ +
              2.1  联合使用 OLA 和 ENZ 对抑制前列腺癌细胞具                    OLA 处理后进行二代高通量测序并进行差异基因
              有协同效应                                             富集分析，发现联合用药组对比单药组的凋亡通路
                  利用 CCK⁃8 检测 OLA 和 ENZ 对 C4⁃2 的 IC50 （表        基因表达显著增加。为了进一步验证其单药及联
              1）。使用 CCK⁃8 法继续检测 C4⁃2 在 ENZ、OLA 及                合用药对凋亡的影响，Annexin⁃V 及 FITC/PI 双染细
              ENZ+OLA 组的生长情况并计算其生长率，再使用                         胞并通过流式细胞仪检测细胞凋亡比例（图3A、B），
              CompuSyn 软件计算 CI 值，最终测得 C4⁃2 联合用药                 发现联合使用 ENZ 和 OLA 对比单药均有显著的促

              的CI值为0.49，表明两药联用在前列腺癌细胞系C4                        细胞凋亡作用。接着检测凋亡效应阶段 Caspase 级
              ⁃2中具有强协同作用（图1）。                                   联反应的标志物，发现联合使用ENZ和OLA后对比
                                                                单药显著上调了凋亡效应阶段的 Caspase 级联反应
                     表1   各药物对前列腺癌细胞C4⁃2的IC50                   的水平（图3C）。
                Table 1  IC50 of each drug on prostate cancer cell C4⁃2
                                                                2.4  联合使用ENZ和OLA上调细胞DSB积累
                药物          IC50 （μmol/L）    95% CI（μmol/L）
                                                                     OLA 是 PARP 抑制剂，其选择性抑制 PARP1 及
                ENZ           26.85            22.51~32.27
                                                                PARP2，促使 SSB 显著增多。联合使用 ENZ 和 OLA
                OLA           57.82            47.98~68.74
                                                                后细胞凋亡比例明显增加，其可能是ENZ和OLA协
              2.2 OLA联合ENZ协同抑制前列腺癌细胞体外增殖                        同导致了DNA损伤无法被及时修复，从而出现了凋
                  在后续的细胞实验中，选取IC50的1/4值作为药                      亡。当DSB发生时，其最早的反应之一便是组蛋白
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