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第43卷第12期 余 清，徐 敏，史桂兰，等. 基于全基因组测序的院内耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药性及
2023年12月 同源性分析［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（12）：1729-1736，1763 ·1731 ·

Illumina 数据再次用于验证，最后使用 GapCloser 使用试剂盒提取细菌DNA和质粒DNA，根据全
v1.12 软件用于 gap closing 的工作。全基因组测序 基因组测序结果选择相关的耐药基因和毒力基因，
委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。 在临床泛耐药菌株中进行 PCR 扩增，扩增产物行
1.2.2 多位点序列分型（multilocus sequence typing， 1.2%琼脂糖凝胶电泳，验证携带情况。选择的基因
MLST）和脉冲凝胶电泳（pulse⁃field gel electrophore⁃ 如表1所示。
sis，PFGE）分型
2 结 果
采用7对管家基因对细菌DNA进行PCR扩增，
然后对扩增产物进行序列测定，将测许结果上传至 2.1 全基因组测序结果

数据库，与数据库比对后获取序列分型（sequence KPX全基因组测序全长5 468 925 bp，环状DNA，
type，ST）。 含有 4 个质粒（179 972 bp、141 377 bp、85 181 bp 和
PFGE分型操作为先提取细菌基因组DNA后再 20 247 bp），其中编码蛋白质的基因 5 984 个，tRNA
用限制性内切酶 XbaⅠ（日本 TaKaRa 公司）对菌株 基因 85 个，rRNA 操纵子 25 个。测序结果显示 KPX
基因组进行酶切，酶切片断在特定的电泳系统中通 携带多种抗生素耐药基因，包括 aadA2、rmtB、blaC⁃
过电场方向不断交替变换，电泳 15 h 后充分分离， TX⁃M⁃65、blaKPC⁃2、blaTEM⁃1、blaSHV⁃64、blaSHV⁃
根据电泳条带的位置和大小对细菌进行分型。 11、qnrS1、carA、sul1、sul2 和 catⅡ等。这些基因分
［5］
PFGE分型的判断参照Tenover等 提出的标准。 别能够介导细菌对氨基糖苷类、β内酰胺类、氟喹诺
1.2.3 耐药基因及毒力相关基因的PCR扩增 酮类、大环内酯类、磺胺类和氯霉素的耐药。此外，

表1 本实验中所用引物
Table 1 Primers used in this study
基因名称 序列（5′-3′） 片断长度(bp）
rmpA2_F AGAGTATTGGTTGATAGCCGGA 159
rmpA2_R GAAATGTCAAGCCACATCCATTG
iucABCD_F CCAACTCCGTCCGTACCCTGTCA 838
iucABCD_R CGAGGGATCGACGATGGTGTTCT
iutA_F AATCACCTGGGGGCTGGATGCT 683
iutA_R CCGCACCTTCCACGCCGTAAAT
KPC-2_F GCTACACCTAGCTCCACCTTC 990
KPC-2_R ACAGTGGTTGGTAATCCATGC
NDM-1_F GAAGCTGAGCACCGCATTAG 769
NDM-1_R GGGCCGTATGAGTGATTGC
TEM-1_F ACAGCGGTAAGATCCTTGAGAG 461
TEM-1_R GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCG
SHV-11_F ACCTTTAAAGTAGTGCTCTGC 432
SHV-11_R CACCATCCACTGCAGCAGCTG
CTX-M_F ATGGTTAAAAAATCACTGCGTCACTGCGYCAGTTC 876
CTX-M_R TCACAAACCGTYGGTGACGATTTTAGCCGC
qnrS_F ACGACATTCGTCAACTGCAA 417
qnrS_R TAAATTGGCACCCTGTAGGC
int1_F CAGTGGACATAAGCCTGTTC 161
int1_R CCCGAGGCATAGACTGTA
sul1_F CGGCGTGGGCTACCTGAACG 433
sul1_D GCCGATCGCGTGAAGTTCCG
sul2_F GCGCTCAAGGCAGATGGCATT 289
sul2_D GCGTTTGATACCGGCACCCGT
oqxB_F CTGGATTTTCCGTCCGTTTAAC 068
oqxB_R TTGCCTACCAGTCCCTGATAGC