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第44卷第12期
·1640 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年12月
P0028，上海碧云天）说明书进行，首先进行 RNA 抽 24孔板中，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。待
提，用PBS 清洗1遍，胰酶消化细胞并计数。PBS 清 细胞进入对数生长期后，加入 polybrene 6~8 μg/mL，
洗，低速离心收集细胞。每 20 μL 细胞沉淀加入 加入3 μL病毒，37 ℃孵育4~6 h 换液，继续培养，嘌
200 μL 添加了 RNase Inhibitor（含未稀释的 R0102 呤霉素筛选后进行后续实验研究。
10 μL）的细胞浆蛋白抽提试剂A，混匀，冰浴10~15 min。 1.2.2.5 集落形成实验
加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10 μL，混匀，冰浴1 min。 取各组对数生长期细胞，胰酶消化后，将细胞
4 ℃ 12 000 g离心5 min。吸取上清液加入TRIzol抽 进行倍比稀释。按照每皿含 50、100、200 个细胞的
提细胞浆 RNA。对于沉淀，完全吸尽残余的上清， 浓度分别接种 4 mL 细胞悬液到培养皿中。培养皿
加入 TRIzol 抽提细胞核 RNA。所提取 RNA 即可用 置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2周。当培养皿中
于下游LINC01424表达验证。 出现肉眼可见的克隆时，甲醇固定15 min。用Giemsa
1.2.2.2 cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplifica⁃ 染液染色 10 min 后进行计数。集落形成率=（集落
tion of cDNA end，RACE）实验 数/接种细胞数）×100%。
具体操作方法参考 SMARTer 试剂盒（货号： 1.2.2.6 侵袭实验
634858，TaKaRa公司，日本）说明书。针对3′RACE， 无血清培养基和基质胶按 1∶5 稀释，配制细胞
利用 mRNA 的 3′末端 poly（A）尾作为 1 个引物结合 悬液，每孔加入 100 μL 细胞悬液，下室加入 500 μL
位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的 含 20%胎牛血清的条件培养液，37 ℃培养箱孵育
Oligo（dT）30 作为锁定引物反转录合成标准第 1 链 24 h。取出Transwell板，用5%戊二醛固定，加入Giemsa
cDNA，然后用 1 个基因特异引物 GSP1 作为上游引 染色。用棉球擦去上表面细胞，置于显微镜下观
物，用 1 个含有部分接头序列的通用引物（universal 察，计数。
primer，UPM）作为下游引物，以 cDNA 第 1 链为模 1.2.2.7 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridiza⁃
板，进行 PCR 循环，把目的基因 3′末端的 DNA 片段 tion，FISH）和免疫荧光染色
扩增出来。针对5′RACE实验，先利用GSP作为1个 ECA109 细胞用PBS洗涤3次，每次5 min，然后
引物结合位点，在反转录酶 MMLV 作用下，反转录 用0.5% Triton X⁃100渗透5 min，PBS洗涤3次，每次
合成标准第 1 链 cDNA。利用该反转录酶具有的末 5 min。在37 ℃下杂交过夜后DAPI孵育10 min。使
端转移酶活性，在反转录达到第 1 链的 5′末端时自 用激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像。转染
动加上 3~5 个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有 ECA109 和 KYSE150 细胞培养后，4 ℃用 4%多聚甲
SMART 寡核苷酸序列 Oliogo（dG）通用接头引物配 醛覆盖固定后 PBS 清洗，用含 0.5% Triton X⁃100 的
对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上 PBS 于冰上透化细胞 5 min。在含有地高辛标记的
通用接头。随后 1 个含有部分接头序列的 UPM 作 LINC01424⁃AS 探针（广州锐博）的预杂交液中进行
为上游引物，GSP2作为下游引物，以SMART 第1链 杂交，杂交温度为37 ℃，过夜。杂交后，样品与抗地
cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5′末端的 高辛（Abcam 公司，美国）在 4 ℃ 孵育过夜，并用
cDNA片段扩增出来。最终，通过分析RACE产物确 DAB 底物试剂盒（DA1010；北京索莱宝）染色。用
定 3′末端序列，最终确定 LINC01424 序列。其中 DAPI对载玻片进行反染色，然后用激光扫描共聚焦
GSP1 为 5′ ⁃ TCGGGTCCAGCACCTTCTACTC ⁃ 3′ ， 显微镜进行观察。LINC01424⁃AS 探针序列为：5′⁃
GSP2为5′⁃ACACACTGGCTGCTCAGAG⁃3′。 GACTTTTGTCACTTGAAGCTGAAGCTAATCCTGAT⁃
1.2.2.3 细胞活力实验 AGAAGCTGTAAACCACATTTCTCACAGCGGGTCAA⁃
取对数期生长细胞，铺满 24 孔板培养 48 h 后， TCGGGAAAGCACACCCACTCACTACAGCCATTA⁃3′。
每孔中加 MTT 溶液 20 μL 孵育 4 h 后加入 150 μL 1.2.2.8 实时定量PCR（qRT⁃PCR）
DMSO 溶液，轻轻振荡 10 min，使结晶物溶解充分。 总RNA用TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）提
酶联免疫监测仪上选择 490 nm 波长处测定各孔的 取。细胞核RNA和细胞质RNA分别用细胞质和细胞
吸光度值。 核 RNA 纯化试剂盒（上海贝博）分离。用 NanoDrop
1.2.2.4 慢病毒感染 2000（Thermo Fisher 公司，美国）和琼脂糖凝胶电泳
分别构建LINC01424敲降及过表达慢病毒载体 分析 RNA 的浓度和质量。使用 PrimeScript RT 试
TM
（上海吉玛基因），将待感染细胞以 1×10 个/孔铺到 剂 盒（TaKaRa 公 司 ，日 本 ）进 行 反 转 录 。 采 用
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