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第44卷第12期 曹 靖，肖志寒，王子辰，等. 超保守癌/睾丸⁃LINC01424表达影响食管鳞癌的进展［J］.
2024年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（12）：1638-1648 ·1641 ·

ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞）进行 购于北京维通利华公司。动物饲养环境按标准化
-ΔΔCT 法计算。所用引 清洁级环境进行饲养；恒温恒湿，每日12 h光照，保
qRT⁃PCR。相对表达量采用 2
物序列见表1。 证充足的食物和水。定期更换鼠笼，满足饲养环境
1.2.3 动物实验 的要求。动物实验研究已获南京医科大学第一附
1.2.3.1 动物分组 属医院动物保护与利用机构委员会批准（编号：
实验动物为6~8周龄SPF 级BALB/c 雄性裸鼠， 2022⁃SR⁃055）。

表1 PCR引物序列
Table 1 Primer sequences for PCR

Gene Forward（5′→3′） Reverse（5′→3′）
GAPDH TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC TGCTGACAATCTTGAGGGAG
LINC01424 TCCAGCACCTTCTACTCCGA CTGCCCTGCAGTATCACACA
MALAT1 GCTCTGTGGTGTGGGATTGA GTGGCAAAATGGCGGACTTT

将BALB/c裸鼠随机分为敲降组和对照组，分别 应用 UCSC 网站公布的 32 个物种间 phastCons 评分
取感染 LINC01424 敲降慢病毒的 ECA109 细胞和感 以及 phyloP 评分，在 phyloP>0 且 phastCons>0.3 的条
染空载体病毒的 ECA109 细胞，按照分组，于每只 件下，筛选出74个超保守睾丸优势表达 lncRNA；进
BALB/c裸鼠的腋窝下注射等量的细胞悬液（细胞量 一步采用 Xena 数据库标准化处理的TCGA及GTEx
约为 4×10 个）。动物在标准化SPF 环境下饲养。待 表达数据，对上述74个lncRNA在ESCC组织及正常
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瘤体形成后每 3 d测量1次瘤体体积，30 d后脊髓离 食管黏膜中的差异表达情况进行分析，结果共鉴定
断法处死小鼠，取瘤体称重，瘤体用于后续实验。 出 19 个 ESCC 相关超保守 CT⁃lncRNA（图 1A）。基
1.2.3.2 免疫组化染色 因差异表达分析显示，LINC01424 在肿瘤组织中异
实验采用杭州图凌生物医药试剂盒进行操作 常 高 表 达（ 图 1B）；生 存 分 析 结 果 显 示 ，仅
（货号 I10091），样本首先在 10%福尔马林缓冲液固 LINC01424 与 ESCC 预后显著相关（图 1C）。基于
定，随后经过石蜡包埋、脱蜡、水化后清洗切片，对 GTEx数据库信息分析，LINC01424在正常睾丸组织
切片进行组织抗原热修复；修复后的切片用自来水 中高表达，而在其他正常组织中低表达甚至不表达
清洗。3%的过氧化氢封闭处理后，PBST清洗，Ki⁃67 （图 1D）；此 外 ，对 小 鼠 各 组 织 的 检 测 也 发 现 ，
抗体孵育 30 min 后，PBST 清洗，加酶标羊抗鼠 IgG LINC01424 在正常小鼠睾丸组织中高表达，而在其
室温下孵育 30 min，PBST 缓冲液清洗切片。DAB 他正常组织中低表达甚至不表达（图 1E）。通过
显色液进行显色。自来水清洗，使用苏木素染液复 UCSC Xena数据库分析发现LINC01424 上游启动子
染。切片经过脱水，透明，封片后在显微镜下观察 区域的保守性较高（图 1F）。通过 RACE 实验鉴定
拍摄。 LINC01424 的全长序列，结果显示 LINC01424 全长
1.3 统计学方法 为4 270 bp，5′端获得序列大小为2 329 bp，3′端获得
所有统计分析均使用 R 软件（版本 3.2.30）进 序列大小为 1 888 bp，从而确定 LINC01424 在 ESCC
行。采用卡方检验比较分类变量的组间分布差异， 细胞中的实际全长序列（图1G）。进一步通过RNA⁃
采用 t 检验比较连续型变量的组间差异。采用 Cox FISH实验发现LINC01424在ESCC细胞核及细胞浆
比例风险回归模型评价与 ESCC 预后的关联，调整 均有分布，且在细胞核中呈优势表达（图 1H、I），提
年龄、性别、吸烟、TNM 分期、肿瘤分化程度及肿瘤 示LINC01424可能主要参与细胞核内的转录调控机
部位等变量。采用 GraphPad Prism 7 软件绘制基因 制。以上结果表明，超保守CT⁃LINC01424可能影响
差异表达图及 Kaplan⁃Meier 图。P < 0.05 为差异有 ESCC的进展。
统计学意义。 2.2 LINC01424在ESCC组织及不同分期中的表达

利用课题组 118 对 ESCC⁃癌旁组织进行 qRT⁃
2 结 果
PCR 验证，LINC01424 在 ESCC 组织中异常高表达
2.1 ESCC超保守CT⁃lncRNA的系统性筛选 （图 2A），与 Xena 数据库标准化处理的 TCGA 及
基于系统筛选的4 538个睾丸优势表达lncRNA， GTEx 数据分析结果一致（图 1B）；生存分析结果进