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第44卷第12期        季明德，廖俊进，高彩月，等. SAMD13通过激活ERK1/2对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响［J］.
                 2024年12月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（12）：1649-1656                      ·1651 ·


                数据库（http：//gepia.cancer⁃pku.cn/）分析低级别胶质           2×Taq Plus Master Mix Ⅱ进行PCR扩增反应，PCR产
                瘤（low⁃grade glioma，LGG）和高级别胶质瘤——胶                 物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳（120 V，30 min），
                质母细胞瘤（glioblastma multiforme，GBM）患者肿瘤             进行琼脂糖凝胶成像观察。
                组织中 SAMD13 基因的表达情况，并分析 SAMD13                     1.2.6 Western blot检测
                基因表达与胶质瘤患者预后的相关性。                                     用 RIPA 裂解细胞，将细胞裂解物煮沸后离心
                1.2.2 细胞培养                                       （12 000 g，5 min）取上清，用10%或12%预制混胶行
                    将 U373、U87 和 U251 细胞接种于 3 mL 含 10%            SDS⁃PAGE 电泳，先用 50 V 恒压电泳 30 min 浓缩蛋
                FBS 的 DMEM 完全培养基中，置于 37 ℃、5% CO2培                 白，再用 120 V 恒压电泳 2 h 分离蛋白，接着用 0.3A
                养箱中培养。细胞传代：当细胞融合度为90%左右                           湿转2 h，待蛋白转印到PVDF 膜上后，再用5%脱脂
                时，用 1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，3 mL 完全培                   奶粉室温封闭 2 h，加入 SAMD13（1∶1 000）、t⁃Akt1
                养基终止消化，1 000 r/min 离心 5 min 后重悬细胞，               （1∶1 000）、p⁃Akt1（1∶1 000）、t⁃ERK1/2（1∶1 000）、
                按 1∶3 比例接种于新的细胞培养皿，置于培养箱中                         p⁃ERK1/2（1∶2 000）、t⁃STAT3（1∶1 000）、p⁃STAT3
                继续培养。                                            （1∶2 000）和β⁃actin（1∶100 000）抗体，4 ℃孵育过
                1.2.3 质粒构建                                        夜，用1×TBST洗涤3次，每次15 min，再用HRP标记
                    SAMD13过表达质粒委托通用生物（安徽）股份                       的二抗（1∶10 000）室温孵育 40 min，洗涤 3 次后行
                有限公司构建，以 pIRES2⁃EGFP 质粒作为载体，构                     ECL化学发光试剂检测。

                建 SAMD13 过 表 达 质 粒 ，并 命 名 为 pIRES2 ⁃              1.2.7 CCK⁃8实验
                SAMD13。由南京科瑞斯生物科技有限公司设计并                              将U373细胞接种于96孔板，同时转染各shRNA，
                合成 3 个针对 SAMD13 基因不同靶点的 shRNA 序                   培养 48 h，用无血清 DMEM 配制 10%的 CCK⁃8 工作
                列，并以pRNA3⁃SV40⁃GFP（2A）Puro⁃U6质粒作为载                液，每孔替换 100 μL CCK⁃8 工作液，放置培养箱孵
                体，构建各shRNA表达质粒，分别命名为shSAMD13⁃1                    育，用酶标仪测定在450 nm的吸光度值。
               （5′⁃GCTATCTGTTGACATGGAA⁃3′）、shSAMD13⁃2             1.2.8 侵袭实验
               （5′⁃GGATTTGAGGAGCAAGCTA⁃3′）、shSAMD13⁃3                 将 U373 细胞接种于 Transwell 小室，24 孔板下
               （5′⁃TGCTATTGATGACAAGAAA⁃3′），同时合成对照                 室加入 600 μL DMEM，放置细胞培养箱中，12 h 后
                shRNA（shCTR，5′⁃TTCTCCGAACGTGTCACGT⁃3′）。           弃上清，用 PBS 洗涤 Transwell 小室 3 次，之后将
                1.2.4 细胞转染                                        Transwell 小室放入甲醇中固定 30 min，再用 PBS 次
                    取 6 μL Lipofectamine 2000 和 94 μL 无 血 清       洗涤3次，接着加入结晶紫染色30 min，用PBS洗涤
                DMEM，吹打混匀；另取 2 μg 质粒加入 100 μL 无血                  3 次。擦去 Transwell 小室内部未穿膜的细胞，自然
                清DMEM，吹打混匀；将稀释后的Lipofectamine 2000                干燥，在显微镜下观察并拍照。
                加入稀释后的质粒中，吹打混匀，静置 15 min；弃掉                       1.3  统计学方法
                细胞培养皿中的DMEM，用PBS清洗，加入1.8 mL无                          所有实验均独立重复 3 次，所得定量数据以均
                血清 DMEM，将静置后的 Lipofectamine 2000 和质粒              数±标准误（x ± Sx）表示。采用 SPSS 19.0 统计软件
                混合溶液加入细胞培养皿中，培养8 h后，换含10%                         进行统计学分析，两组间比较采用配对t检验，多组
                FBS的DMEM培养基继续培养。                                  间比较则采用单因素方差分析，Bonfferoni法进行两

                1.2.5 RT⁃PCR                                      两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
                    通过NCBI数据库查找人SAMD13和GAPDH基
                                                                  2  结 果
                因 mRNA 序列，并使用 Primer⁃BLAST 在线设计 PCR
                引物，由通用生物（安徽）股份有限公司合成。引物                           2.1  胶质瘤患者肿瘤组织和细胞系中 SAMD13 的

                序列如下：SAMD13（上游 5′⁃GTGCTTTTCAGGAA⁃                 表达情况
                CAGGAAAT⁃3′；下游 5′⁃CCTTTGTGGGGAGGAGT⁃                  首先使用 GEPIA 数据库分析胶质瘤患者肿瘤
                GTC⁃3′）；GAPDH（上游 5′⁃GCGTCGCCAGCCGAG⁃              组织中 SAMD13 的表达情况，结果发现与癌旁正常
                3′；下游 5′⁃TGGAATTTGCCATGGGTGGA⁃3′）。用               组织比较，SAMD13 在患者肿瘤组织中显著高表达

                VeZol 裂解细胞，提取细胞总 RNA，再用 HiScript Ⅱ               （图 1A），且 GBM 组织中 SAMD13 表达量多于 LGG，
                QRT SuperMix 逆转录为 cDNA，以 cDNA为模板，用                并与患者的不良预后密切相关（图1B）。之后，选用
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