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第44卷第12期             尹建星，成张淳，王协锋，等. IBSP激活NF⁃κB通路促胶质母细胞瘤恶性进展［J］.
                 2024年12月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（12）：1662-1670                      ·1663 ·


                白，主要参与骨骼相关细胞的组成，包括肥大软骨                            质粒转染。取合适的EP管加入1 500 μL（250 μL/孔）
                               ［4］
                细胞、成骨细胞等 。近年来，越来越多的证据表明                           Opti⁃MEM，加入60 μL（10 μL/孔）Lipofectamine 2000
                IBSP 在肿瘤进展中发挥重要作用。数据库分析发                          混匀，室温静置 5 min。另取 EP 管加入 250 μL/孔
                现，IBSP在多种肿瘤中表达水平显著增高，如侵袭性                         Opti⁃MEM，再加入4 μg/孔siRNA轻轻混匀。将Lipo⁃
                乳腺癌、结肠癌、骨肉瘤等 。研究表明，IBSP可通过                        fectamine 2000 稀释液加入到 siRNA 稀释液中，轻
                                      ［5］
                激活 Fyn/β⁃catenin 信号通路促进结肠癌进展              ［6］ 。   柔混匀，室温静置 30 min。细胞在转染前 1 h 更换
                此外，IBSP 还可通过激活 BMP/SMAD 信号通路或                     新的无双抗无血清培养液。将制备好的 siRNA⁃
                协同 miR⁃19a 促进乳腺癌增殖及骨转移              ［7-8］ 。然而     Lipofectamine 2000 复合物分别加入细胞培养液中，
                IBSP 在胶质瘤中的表达、功能及潜在作用的分子                          将培养板轻轻摇动使复合物分布均匀。放入37 ℃、
                机制尚不清楚。本研究探讨了IBSP在GBM样本中                          5% CO2培养箱培养，并在4~6 h后更换完全培养液，
                的表达水平及其与患者预后的相关性，同时探索了                            24~48 h后进行后续实验。
                IBSP 对 GBM 增殖、侵袭、化疗耐药的调控作用及调                      1.2.4  qRT⁃PCR
                控机制，为GBM的治疗提供新的潜在靶点。                                  TRIzol 提取细胞 RNA，并通过 Nanodrop 2000/

                                                                  2000c 分 光 光 度 计 检 测 RNA 浓 度 。 使 用 Prime
                1 材料和方法
                                                                  Script RT Master Mix 反转录试剂盒将 RNA 反转录
                1.1  材料                                           为 cDNA。按 qRT⁃PCR 反应体系配制反应溶液，包
                    实验所用细胞（正常星形胶质细胞 NHA 和                         括上下游引物各 1 μL，SYBR Green Master 2 μL，
                GBM 细胞系 U87、LN229、LN18、D54、T98G、U251S、            cDNA 1 μL，DEPC水 5 μL；IBSP上游引物：5′⁃AAGG⁃
                U251T3rd、N3S、N3T3rd）由本实验室保存。                      GCACCTCGAAGACAAC⁃3′，下游引物：5′⁃CCCTCG⁃
                    DMEM 培养液、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；                   TATTCAACGGTGGT⁃3′；GAPDH上游引物：5′⁃AGA⁃
                Lipofectamine 2000 转 染 试 剂（11668030，Thermo        CAGCCGCATCTTCTTGT⁃3′，下游引物：5′⁃TGATG⁃
                Fisher 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒、细胞裂解液（上                   GCAACAATGTCCACT⁃3′。使用 ABI StepOnePlus        TM
                海碧云天）；Transwell 小室、Matrigel 基质胶（Coring            实时PCR系统行qRT⁃PCR检测。
                公司，美国）；Annexin V⁃FITC/PI 细胞凋亡检测试剂                 1.2.5  Western blot
                盒（上海翌圣生物）；IBSP抗体（#5468，Cell Signaling                 使用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA 法
                Technology 公司，美国）；p⁃p65 抗体（82335）、p65 抗           测定蛋白浓度。取等量蛋白加入 Loading Buffer 后
                体（10745）、GAPDH 抗 体（60004）、羊 抗 鼠 二 抗               煮沸，SDS⁃PAGE 分离蛋白，80 V恒压电泳约20 min
               （RGAM001）、羊抗兔二抗（RGAR001）（Proteintech               后，调整为 120 V 恒压电泳。电泳完成后转移蛋白
                公司，美国）；IBSP siRNA 质粒（干扰序列：5′⁃GCCU⁃                至 PVDF 膜，5%脱脂牛奶摇床室温封闭 2 h。TBST
                AUGAAGAUGAGUACA ⁃ 3′）、IBSP 过 表 达 质 粒 及            清洗 PVDF 膜，4 ℃摇床上一抗孵育过夜。TBST 洗
                PCR引物由上海吉凯公司合成。                                   3 次，每次 10 min。二抗室温孵育 2 h 后，TBST 洗膜
                1.2  方法                                           3次，每次10 min。使用ECL显影液曝光。
                1.2.1 公共数据库信息检索                                   1.2.6 CCK⁃8实验
                    本研究所用胶质瘤数据来自 TCGA、CGGA、                           将对数生长期GBM细胞按每孔2 000个接种至
                Rembrandt、Gravendeel 数据库，单细胞数据下载自                 96孔板中，分别在24、48、72 h按CCK⁃8试剂盒说明
                GEO（GSE182109）数据库。                                书检测细胞在450 nm处的吸光度。

                1.2.2  细胞培养                                       1.2.7  克隆形成实验
                    细胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素                            取对数生长期GBM细胞，将细胞按每孔2 000个
                的 DMEM 培养液，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，                   接种至 6 孔板中培养 2 周，每 3 d 更换新鲜培养液。
                每2~3 d换液或传代，以维持细胞处于对数生长期。                         吸除培养液后PBS清洗3次，甲醇固定30 min，0.1 %

                1.2.3  质粒转染                                       结晶紫染色 30 min，PBS 洗 3 次，晾干后进行细胞克
                    将对数生长期细胞按5×10 个/孔接种至6孔板                       隆计数。
                                            4
                中，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞生长                      1.2.8 Transwell侵袭实验
                至60%密度时使用Lipofectamine 2000按说明书进行                     将Matrigel基质胶与培养液按1∶4比例混合，均
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