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第44卷第12期
               ·1658 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年12月


              机制仍不明确。多种微小RNA（microRNA，miRNA）                    1.2.3  细胞转染
                                                                                                              5
              被证明参与免疫反应，特别地，miRNA⁃146a（miR⁃                          取对数生长期的RAW264.7细胞系，每孔4×10
              146a）被证实通过靶向抑制肿瘤坏死因子受体相关                          个细胞种植于 6 孔板中培养 24 h，50 nmol/L miR⁃
              因子 6（tumor necrosis factor receptor⁃associated factor  146a mimic 或 miR⁃146a inhibitor，以及相应的阴性
              6，TRAF6），可 负 性 调 节 Toll 样 受 体 4（Toll⁃like         对照通过 Lipofectamine2000 进行转染，具体转染步
                                 ［3］
              receptor 4，TLR4）通路 。然而，miR⁃146a能否通过               骤参照试剂盒说明书，转染后24 h收集标本或进行
              抑制TLR4信号通路，减轻IRI还有待深入研究。本                         缺氧⁃复氧实验。
              研究通过建立体外巨噬细胞缺氧⁃复氧模型模拟缺                            1.2.4  实时定量PCR
              血再灌注过程，并通过定量PCR及蛋白印迹实验研                                应用TRIzol提取细胞总RNA，并测定RNA浓度

              究此过程中 miR⁃146a 的表达水平，以及 TRAF6                     及纯度。然后通过反转录试剂盒将总 RNA 逆转录
              mRNA和蛋白的表达水平，并通过转染miR⁃146a模拟                      成 cDNA，设计引物序列，TRAF6 上游引物：5′⁃CCT⁃
              物（miR⁃146a mimic）及抑制物（miR⁃146a inhibitor），        GGGTTATGTGCCGCTT⁃3′，下游引物：5′⁃GAGGAT⁃
              验证其对 TRAF6 的调控以及对巨噬细胞炎症因子                         GTGAACGAGGTCAGC⁃3′；β⁃actin 上游引物：5′⁃GT⁃
              和 ROS 释放的调节作用，为减轻组织器官 IRI 提供                      GACGTTGACATCCGTAAAGA ⁃ 3′ ，下 游 引 物 ：5′ ⁃
              新的方向和治疗策略。                                        GCCGGACTCATCGTACTCC ⁃ 3′ 。 最 后 通 过 SYBR
                                                                Green定量PCR试剂盒进行定量检测。
              1 材料和方法
                                                                     为检测 miR⁃146a 的表达，首先利用 Taqman            TM
              1.1  材料                                           MicroRNA 反转录试剂盒进行逆转录，具体操作按
                  小鼠巨噬细胞系RAW264.7购于中国科学院上                       说明书进行，然后应用 miRNA 特异性 Taqman 探针
              海细胞资源中心。                                          和Taqman Universal PCR Master Mix进行miR⁃146a
                                                                         TM
                  胎牛血清、DMEM 培养基、无糖 DMEM 培养基、                    的实时定量检测，RNU6B作为内参。所有实时定量
              0.25%胰酶（Gibco 公司，美国）；AnaeroPack⁃Anaero            反应均在 ABI StepOnePlus real⁃time PCR system 上
              缺氧袋（MGC公司，日本）；TRAF6及β⁃actin的引物、                   进行，每个反应设3个复孔。
              TRIzol、Lipofectamine2000（Invitrogen 公司，美国）；       1.2.5  Western blot
                     TM  MicroRNA 反转录试剂盒、miR⁃ 146a 及                 细胞用含 1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行
              Taqman
              RNU6B 特异性 Taqman 探针和 Taqman         TM  Universal  裂解，蛋白样品在10% SDS⁃PAGE中电泳，然后将蛋
              PCR Master Mix（ABI公司，美国）；TRAF6、β⁃actin一           白转移至 PVDF 膜，5%脱脂牛奶在室温下封闭 1 h，
              抗（Santa 公司，美国）；miR⁃146a mimic、miR⁃146a            加一抗（anti⁃TRAF6、anti⁃β⁃actin）在 4 ℃过夜，然后
              inhibitor 以及相应的阴性对照（上海吉玛公司）；                      在室温下加HRP标记的二抗孵育1 h。常规ECL曝
              Valukine ELISA kit（RD公司，美国）；Dual⁃Glo luciferase   光、扫描成像。
              Reporter Assay System（Promega公司，美国）。              1.2.6  ELISA
              1.2  方法                                                收集细胞上清液，按照 ELISA 试剂盒说明进行
              1.2.1 细胞培养                                        操作，检测上清液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis
                  在恒温 37 ℃、含 5% CO2的细胞培养箱中进行                    factor α，TNF⁃α）的含量，实验重复3次。

              细胞培养，培养基为添加了 10%胎牛血清、50 U/mL                      1.2.7  双荧光素酶报告分析
              青霉素和50 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基。                              pmirGLO、pRL⁃TK 荧光素酶质粒购于美国 Pro⁃

              1.2.2  缺氧⁃复氧实验                                    mega公司，设计的野生和突变型寡聚核苷酸序列由
                            ［4］
                  参考 Liu 等 报道的细胞缺氧⁃复氧模型，取对                      上海 Invitrogen 公司合成，通过限制性核酸内切酶
              数生长期的 RAW264.7 细胞系，每孔 4×10 个细胞                    NheⅠ、XhoⅠ位点插入 pmirGLO 质粒，构建完成
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              种植于 6 孔板中培养 24 h，换成无血清无糖培养                        pmirGLO⁃TRAF6⁃wt/mut质粒，构建的质粒测序证实
              基，置于 AnaeroPack⁃Anaero 缺氧袋内，通过氧指示                 构建成功。为了进行双荧光素酶报告分析，将miR⁃
              剂显示袋内氧含量低于 5%时再培养 1 h，拿出并                         146a mimic 或其对照和 pmirGLO⁃TRAF6⁃wt/mut 质
              换成完全培养基继续培养 6 h 后收集细胞及细胞                          粒、pRL⁃TK 质粒共同转染进 RAW264.7 细胞中，转
              上清液。                                              染 24 h 后应用 Dual⁃Glo Luciferase Reporter Assay
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