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第44卷第12期 蒋承烨，倪明明，孙 尧，等. miR⁃146a通过抑制TRAF6减轻缺氧诱导的巨噬细胞炎症反应［J］.
2024年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（12）：1657-1661，1689 ·1659 ·

System在GloMax 20/20 Luminometer上检测。 放。实验重复3次。
野生型寡聚核苷酸序列：正义链 5′⁃CTAGC⁃ 1.3 统计学方法
GTTCTCATGGTCAGAAGTTCTCATC⁃3′，反义链 5′⁃ 运用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料以
TCGAGATGAGAACTTCTGACCATGAGAACG⁃3′；突 均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采用 t 检验，
变型寡聚核苷酸序列：正义链 5′⁃CTAGCTTCTCAT⁃ P < 0.05为差异有统计学意义。
GGTCAGACTGGAGACTC⁃3′，反义链 5′⁃TCGAGA⁃
2 结 果
GTCTCCAGTCTGACCATGAGAACG⁃3′（下划线为酶
切位点，加粗部分为靶向序列）。 2.1 巨噬细胞系中缺氧⁃复氧模型的建立

1.2.8 ROS测定 建 立 细 胞 缺 氧 ⁃ 复 氧 模 型 ，定 量 PCR 显 示
经处理的细胞用无血清的DMEM培养基漂洗3 RAW264.7 细胞经过 1 h 缺氧和 6 h 再复氧后 miR⁃
遍，用5 μmol/L超氧化物阴离子荧光探针（上海碧云 146a 的表达明显下降（图 1A），而 TRAF6 的表达则
天）在 37 ℃细胞培养箱中孵育 30 min，然后在荧光 明显升高（图 1B）。ELISA 检测细胞上清发现炎症
倒置显微镜下观察，红色荧光标记代表 ROS 的释 因子TNF⁃α在缺氧⁃复氧后分泌也明显增加（图1C）。

A B C
1.5 P < 0.05 mRNA expression 6 P < 0.001 20 P < 0.001
Realtive miR⁃146a expression 1.0 Realtive TRAF6 4 2 （ng/mL） TNF⁃α 10 5
15

0.5

0 0 0
Control HR Control HR Control HR
A：The expression level of miR⁃146a in macrophages of the control group and the HR group. B：TRAF6 mRNA expression in macrophages of the
control group and the HR group. C：Concentration of TNF⁃α in macrophage supernatant the control group and the HR group. Each experiment was
repeated three times. HR：hypoxia⁃reoxygenation（n=3）.
图1 巨噬细胞缺氧⁃复氧诱导
Figure 1 Induction of hypoxia⁃reoxygenation in macrophages

2.2 miR⁃146a调控TRAF6的表达 了 pmirGLO⁃TRAF6⁃wt 质粒中荧光素酶活性（图
为了验证 miR⁃146a 对 TRAF6 的表达调控，将 3B）。以上结果表明miR⁃146a在巨噬细胞中直接靶
miR⁃146a mimic 或 miR⁃146a inhibitor 分别转染入 向TRAF6并下调其表达。
RAW264.7细胞中。qPCR结果显示，转染miR⁃146a 2.4 miR⁃146a减轻巨噬细胞炎症反应
mimic 明显增加了细胞中miR⁃146a的表达（图2A）， 通过 ELISA 检测细胞上清，发现过表达 miR⁃
而且Western blot结果显示缺氧⁃复氧后TRAF6的蛋 146a 的巨噬细胞缺氧⁃复氧后炎症因子 TNF⁃α的分
白表达被抑制（图 2C）。相反地，miR⁃146a inhibitor 泌较对照组明显减少，而转染 miR⁃146a inhibitor 后
有效抑制了 miR⁃146a 的表达（图 2B），同时 TRAF6 可以观察到相反的现象（图 4A）。同时在检测细胞
的蛋白表达明显增加（图2D）。 ROS时也发现了类似的改变（图4B）。

2.3 miR⁃146a靶向结合TRAF6
3 讨 论
为了进一步确定 TRAF6 是否是 miR⁃146a 的直
接靶点，通过 microRNA 靶点预测软件 Target Scan IRI 是影响组织器官功能维持的关键因素，其
5.2得到了miR⁃146a可能结合TRAF6的3′非翻译区 病理过程包括免疫系统的激活、ROS 的释放、细胞
（3′untranslated region，3′UTR），并以此构建了质粒 的凋亡与损伤等 ，而其中巨噬细胞被证明参与多
［1］
［5］
pmirGLO⁃TRAF6⁃wt/mut（图 3A）。最后应用双荧光 种器官的 IRI 过程 。多项研究表明缺血再灌注可
素酶报告分析，发现转染 miR⁃146a mimic 明显降低 诱导巨噬细胞浸润并释放多种炎症因子，包括白介