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第44卷第12期
               ·1664 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年12月


              匀涂抹至Transwell小室膜上面，37 ℃培养箱中放置                     图1A）。进一步通过PCR及Western blot 检测发现，
              1 h，待基质胶凝固后，使用无血清培养液将细胞密                          IBSP 在 GBM 细胞系中表达水平显著高于正常星形
              度调整至 1×10 个/mL，吸取 100 μL 细胞悬液加至                   细胞（P < 0.01，图1B、C）。利用胶质瘤单细胞数据集
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              小室中，小室下方孔板中加入 600 μL 完全培养                        （GSE182109）分析发现，IBSP 在 GBM 中表达水平显
              液。37 ℃培养 48 h 后取出小室，弃培养液，棉签轻                      著高于星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤（P < 0.01，图
              轻擦拭掉基质胶及小室内细胞，PBS洗3次，甲醇固                          1D）。TCGA、CGGA、Rembrandt 和 Gravendeel 数据
              定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，PBS洗3次，显微                 库分析结果表明，IBSP表达水平随GBM级别增高而
              镜下计数细胞。                                           增高（P < 0.01，图1E）。上述结果提示，IBSP可能作

              1.2.9  3D肿瘤球体侵袭实验                                 为癌基因促GBM恶性进展。
                  将1滴细胞悬浮液（约20 μL，含有约1 000个细                    2.2  IBSP表达水平增高与GBM预后不良相关
              胞）置于10 cm培养皿的盖子上，然后将培养皿盖子                              收 集 CGGA、Rembrandt 和 Gravendeel 数 据 库
              翻转盖在含有10 mL PBS的培养皿上。将细胞悬液                        GBM 患者预后数据，按 IBSP 表达量中位数将 GBM
              置于培养箱中培养 48 h。使用 1 mol/L NaOH 将含                  患者分为高表达和低表达两组，Kaplan⁃Meier 生存
              2%胎牛血清的 DMEM 调至 pH7.5 用于制备胶原蛋                     分析结果提示，IBSP高表达与GBM患者预后较差显
              白Ⅰ凝胶（PureCol，Inamed 公司，美国），在 96 孔板                著相关（P < 0.01，图 2A~C）。进一步利用 TCGA 数
              中加入胶原蛋白Ⅰ凝胶，4 ℃离心消除气泡。将收                           据库行单因素 Logistic 回归分析发现，IBSP 是 GBM
              获所得的细胞聚集体加入三维胶原蛋白Ⅰ凝胶                              的独立危险因素（P < 0.01，图2D）。
              中。在37 ℃条件下聚合后，用300 μL含10%胎牛血                      2.3  IBSP促进GBM细胞增殖和侵袭
              清的 DMEM 覆盖胶原凝胶。将 96 孔板置于细胞培                            为明确 IBSP 对 GBM 细胞恶性表型调控作用，
              养箱中培养。24 h 后使用 Leica DMI3000B 显微镜                 分别在 U87 和 LN229 细胞中敲低 IBSP。Western
              系统观察实验结果。                                         blot结果显示，与对照细胞相比，敲低组细胞中IBSP
              1.2.10  流式细胞仪检测凋亡                                 表达水平显著降低（图3A）。CCK⁃8结果表明，敲低
                  提前将状态良好的细胞接种于 6 cm 培养皿                        IBSP 可短时间显著抑制 U87 和 LN229 细胞增殖
              中，待完全贴壁，给予细胞 200 μmol/L 替莫唑胺                     （P < 0.01，图 3B）。同时，克隆形成实验结果表明，
             （temozolomide，TMZ）处理 24 h，次日吸除培养液，                 敲低 IBSP 可在较长时间内抑制 GBM 细胞增殖（P <
              PBS 清洗 3 次，胰酶消化后离心，去上清，PBS 重悬                     0.01，图3C）。Transwell实验发现，敲低IBSP显著降
              细胞沉淀，细胞计数后调整每管细胞数为1×10 个，                         低GBM细胞侵袭能力（P < 0.01，图3D）。3D肿瘤球
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              1 000 r/min 离心5 min，吸除上清，200 μL 1×Binding         体侵袭实验进一步证实，敲低 IBSP 抑制 GBM 侵袭
              Buffer重悬细胞。加入5 μL Annexin V⁃FITC和10 μL            能力（P < 0.01，图3E）。上述结果表明，IBSP对维持
              PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应 10~             GBM细胞增殖和侵袭能力至关重要。
              15 min。加入 400 μL 1×Binding Buffer，混匀后放置           2.4  IBSP促GBM细胞化疗耐药
              于冰上，样品在1 h内用流式细胞仪检测。                                   CGGA数据库分析发现，IBSP在复发（recurrent，
              1.3  统计学方法                                        Rec）胶质瘤样本中表达水平显著高于原发（primary，
                  使用 GraphPad Prism9.0 分析数据并制图。定                Pri）样本（P < 0.01，图 4A）。预后分析发现，TMZ 可
              量实验数据采用均数±标准差（x ± s）表示，使用                         显著改善IBSP低表达GBM患者生存（P < 0.001），而
              Student’s t检验行两组间比较，使用ANOVA单因素                    对IBSP高表达GBM患者预后无改善作用（P = 0.087，
              方差分析行多组间比较，Kaplan⁃Meier 绘制生存曲                     图4B），提示IBSP可能参与调控GBM细胞TMZ化疗
              线，Log⁃rank 行生存分析，P < 0.05 为差异有统计学                 耐药性。课题组既往成功构建了两株 TMZ 耐药
                                                                                             ［9］
              意义。                                               GBM 细胞系 U251T3rd 和 N3T3rd 。Western blot 和
                                                                qRT⁃PCR检测发现，IBSP在耐药细胞中表达水平显
              2 结    果
                                                                著高于敏感细胞 U251S、N3S（图 4C、D）。在 TMZ 敏

              2.1  IBSP在GBM组织和细胞系中表达水平增高                        感细胞系中过表达ISBP，并在TMZ耐药细胞系中敲
                  Rembrandt和Gravendeel数据库分析发现，IBSP              低IBSP（图4E、F），再行TMZ处理后，流式细胞仪检测
              在GBM中表达水平显著高于正常脑组织（P < 0.01，                      发现，过表达IBSP后细胞凋亡水平显著降低（图4G），
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