Page 28 - 南京医科大学自然版
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第44卷第9期
               ·1200 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年9月


              激 GMC 诱导 IL⁃23 表达的影响，拟揭示 Thy⁃1N 大                 30 min。行乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）
              鼠肾组织早期炎症的参与因素，为MsPGN的深入研                          法检查GMC溶解的百分率（GMC溶解率<5%时被视
              究提供必要的实验依据。                                       为形成了 sublytic C5b⁃9 复合物）。本实验确定以
                                                                5% ATS 与 4% NHS 作为形成 sublytic C5b⁃9 的最佳
              1  材料和方法
                                                                剂量。
              1.1  材料                                           1.2.4 质粒转染与表达验证
                  雄性SD大鼠（180~200 g）来源于南京医科大学                         用 Lipofectamine 2000 将 shCTR 质粒转染 GMC，
              实验动物中心，动物实验操作经南京医科大学实验                            48 h后观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，

              动物伦理委员会批准（IACUC⁃2011007）。大鼠GMC                    GFP）的表达，以评估其转染效率。之后，同法给
              细胞株HBZY⁃1由武汉大学中国典型培养物保藏中                          GMC 转染 pIRES2⁃EGFP 或 pIRES2⁃KLF5 质粒 48 h，

              心提供。多克隆兔抗大鼠胸腺细胞血清（anti⁃thy⁃                       或转染 shCTR 或 shKLF5 质粒 48 h，再给予 sublytic
              mocyte serum，ATS）由本实验室制备（用 56 ℃水浴                 C5b⁃9 刺激 6 h。提取细胞蛋白，Western blot（WB）
              30 min灭活补体）。正常人血清（normal human serum，             检测KLF5和IL⁃23的表达水平。

              NHS）来源于30位健康志愿者。单克隆鼠源性KLF5                        1.2.5 WB实验
              和 IL⁃23 抗体（Santa Cruz 公司，美国），RIPA 裂解液                  大鼠肾组织或 GMC 中加 RIPA 裂解液，离心收

             （上海碧云天生物科技有限公司），Lipofectamine2000                  集上清测定其蛋白浓度。然后，取 30 μg 蛋白上样
             （Thermo Fisher Scientific 公司，美国），Hieff qPCR        于10%的SDS⁃PAGE中，先用50 V电泳30 min（浓缩
              SYBR Green Master Mix（上海翊圣生物科技有限公                 蛋白），再用120 V 电泳2 h。接着用0.3 A 恒流湿转
              司），双荧光素酶报告基因检测试剂盒、pGL3⁃basic、                     2 h。PVDF膜用脱脂牛奶封闭2 h，加KLF5或IL⁃23
              pRL⁃SV40质粒（Promega公司，美国），pIRES2⁃EGFP              抗体，4 ℃孵育过夜。次日，用 TBST 洗涤 3 次，再用
              质粒（Clontech 公司，美国）。IL⁃23 全长启动子荧光                  HRP 标记的二抗室温孵育 1 h，最后加入 ECL 发光
              素酶报告基因质粒（pGL3⁃IL⁃23⁃FL）、KLF5 过表达                  液并予曝光。
              质粒（pIRES2⁃KLF5）、KLF5 小干扰质粒（shKLF5）、               1.2.6 实时荧光定量PCR（RT⁃qPCR）
              shRNA 对照质粒（shCTR）、慢病毒包装的 shKLF5                        用 TRIzol 提 取 GMC 的 总 mRNA，逆 转 录 为
             （LV⁃shKLF5）和shCTR（LV⁃shCTR）由本课题组前期                 cDNA。另用Primer Premier 5软件设计大鼠IL⁃23的
              分别委托通用生物（安徽）股份有限公司和上海吉                            PCR 引物，并委托南京金斯瑞生物技术有限公司合
              玛制药技术有限公司构建。                                      成。IL⁃23 引物序列是：上游，5′⁃TGTGCCTAGGAG⁃
              1.2  方法                                           TAGCAGTC⁃3′，下游，5′⁃TCCATTTGTCCCACTGGT⁃
              1.2.1 Thy⁃1N大鼠模型的复制                               GT⁃3′。RT⁃qPCR反应体系为cDNA模板1 μL，Hieff
                  取雄性 SD 大鼠（180~200 g），经尾静脉注射含                  qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各
              Thy⁃1 抗体（Thy⁃1 antibody，Thy⁃1 Ab）的 ATS（剂量         0.4 μL，DEPC 水 补 足 至 20 μL。 在 ABI StepOne⁃
              为0.75 mL/100 g），在注射后1、2、3、6、12 h取大鼠的              Plus TM  PCR 仪上行扩增反应，程序为：保温阶段
              肾组织（n=5/时间点），实验以0 h无处理的肾组织作                      （95 ℃ 5 min）、循环阶段（95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共
              对照。之后，提取肾组织中的蛋白质以检测目的蛋                            40 个循环）和溶解曲线阶段（95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、
              白的表达。                                             95 ℃ 15 s）。每样本设 3 复孔，β⁃actin 做内参基因，
              1.2.2 GMC的培养                                      采用2   -ΔΔCt 计算相对倍数。
                  将大鼠 GMC 细胞株接种于含 10%胎牛血清的                      1.2.7 荧光素酶报告基因实验
              MEM完全培养液中，37 ℃、5% CO2孵箱内培养48 h。                        将 GMC 用 sublytic C5b ⁃ 9 刺 激 6 h，或 转 染
              当细胞密度达 80%时，PBS 洗涤后予 0.25%胰蛋白                     pIRES2⁃EGFP或pIRES2⁃KLF5质粒及pGL3⁃IL⁃23⁃FL
              酶消化细胞。1 000 r/min 离心 5 min，弃去上清，再                 联 同 pRL ⁃ SV40 内 参 质 粒 48 h。 另 将 shCTR 或
              按1∶3比例稀释进行传代培养。                                   shKLF5 质粒与 pGL3⁃IL⁃23⁃FL 和 pRL⁃SV40 质粒共
              1.2.3 Sublytic C5b⁃9刺激GMC的剂量                      转染 GMC 48 h，再加 sublytic C5b⁃9 刺激 6 h（针对
                  采用棋盘滴定法        ［8-10］ ，即先以不同浓度的 ATS           shCTR 或 shKLF5 转染组）。之后，用 1×被动裂解缓
              致敏 GMC 30 min，再添加不同浓度的 NHS 孵育                     冲液（passive lysis buffer，PLB）处理上述 GMC，行荧
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