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第44卷第9期 刘 玉，应 帅，罗 灿，等. Sublytic C5b⁃9上调KLF5促进Thy⁃1肾炎大鼠肾小球系膜细胞
2024年9月 生成IL⁃23的作用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（9）：1198-1206 ·1203 ·

A 5 B C D KLF5
mRNA level 4 3 * Δ pIRES2⁃EGFP shCTR+sublytic C5b⁃9 5 4 3 IL⁃23 ** ΔΔ ΔΔ
shKLF5+sublytic C5b⁃9
pIRES2⁃KLF5
**
Relative IL⁃23 2 1 0 ## KLF5 51 kDa KLF5 shCTR 51 kDa Relative protein level 2 1 ## ##
19 kDa
IL⁃23
0
IL⁃23
pIRES2⁃KLF5
pIRES2⁃EGFP shKLF5+sublytic C5b⁃9 β⁃actin 42 kDa β⁃actin 19 kDa pIRES2⁃EGFP shKLF5+sublytic C5b⁃9
shCTR
shCTR+sublytic C5b⁃9
pIRES2⁃KLF5
shCTR+sublytic C5b⁃9
shCTR
42 kDa
GMCs were transfected with pIRES2⁃KLF5 plasmid for 48 h or shKLF5 plasmid for 48 h followed by sublytic C5b⁃9 stimulation for 6 h. A：The
mRNA level of IL⁃23 was measured by RT⁃qPCR. B-C：The protein levels of KLF5 and IL⁃23 were measured by WB. D：Semi⁃quantitative analysis of
ΔΔ
*
Δ
**
WB（figure 4 B and C）. Compared with the pIRES2⁃EGFP group，P < 0.05，P < 0.01；compared with the shCTR group，P < 0.05， P < 0.01；com⁃
##
pared with the shCTR+sublytic C5b⁃9 group，P < 0.01（n=3）.
图4 GMC中过表达或敲低KLF5后对IL⁃23表达的影响
Figure 4 Effect of KLF5 overexpression or knockdown on IL⁃23 expression in the GMC
粒）共同转染GMC 48 h，其中转染shKLF5的GMC再 A 4
加sublytic C5b⁃9刺激6 h。测定IL⁃23启动子的活性 **
发现，sublytic C5b⁃9刺激的GMC（图5A）或在GMC中 2 promoter activity 3
过表达KLF5（图5B）均可明显升高IL⁃23启动子的活
性，但沉默KLF5基因后由sublytic C5b⁃9刺激诱导的
IL⁃23启动子活性则未见显著提高（图5B）。 0 Relative IL⁃23 1
2.6 LV⁃shRNA 感染 GMC 的剂量及大鼠肾脏导入
LV⁃shRNA的确定 MEM sublytic C5b⁃9
B
7 6
先将 LV⁃shCTR 制备成 3 种滴度（即 1×10 、1×
10 、1×10 TU/mL），分别感染GMC 72 h，观察GFP表 promoter activity * ΔΔ
6
5
达发现，3 种滴度的 LV⁃shCTR 均能感染大鼠 GMC， 4
但以1×10 TU/mL滴度感染后GFP表达最强，效率可
7
达90%以上（图6A）。选用最佳滴度的LV⁃shCTR行 2 ##
［22］
大鼠动脉灌注术 ，将其导入肾组织，同时设生理盐 0 Relative IL⁃23
水灌注对照组。实验72 h时，取出大鼠心、肝、脾、肺
shCTR
pIRES2⁃KLF5
shKLF5+sublytic C5b⁃9
和肾，进行可见光三维成像。结果显示，LV⁃shCTR灌 pIRES2⁃EGFP shCTR+sublytic C5b⁃9
注大鼠的肾脏荧光强度显著高于生理盐水灌注大鼠
的肾脏，而其他脏器的荧光强度未见明显增强（图
A：GMCs were transfected with pGL3⁃IL⁃23⁃FL plasmid for 48 h
6B）。另取大鼠肾脏进行冰冻切片，行荧光显微镜 followed by sublytic C5b⁃9 stimulation for 6 h，and IL⁃23 promoter activity
观察证实，大鼠肾小球和肾小管部位均见 GFP 荧 was determined by luciferase reporter assay. B：GMCs were co⁃transfected
光，其中肾小球更为显著（图 6C）。以上结果表明， with pGL3⁃IL⁃23⁃FL and pIRES2⁃KLF5 or shKLF5 plasmids，then IL⁃23
promoter activity was determined by luciferase reporter assay. Compared
LV⁃shCTR 不仅能有效地感染GMC，而且经肾动脉灌
*
**
with the MEM or the pIRES2⁃EGFP group，P < 0.05，P < 0.01；com⁃
注后能将其有效地导入大鼠肾组织。 pared with the shCTR group， P < 0.01；compared with the shCTR+sub⁃
ΔΔ
##
2.7 敲低 KLF5 表达对 Thy⁃1N 大鼠肾组织中 IL⁃23 lytic C5b⁃9 group，P < 0.01（n=3）.
图 5 Sublytic C5b⁃9 刺激 GMC 和高低表达 KLF5 后 IL⁃23
蛋白表达的影响
启动子活性的变化
将大鼠分为 NS、Thy⁃1N、LV⁃shCTR+Thy⁃1N 和 Figure 5 The change of IL ⁃ 23 promoter activity in the
LV⁃shKLF5+Thy⁃1N 4组，后两组先经肾动脉灌注相 GMC after sublytic C5b⁃9 stimulation and KLF5
应的 LV⁃shCTR 或 LV⁃shKLF5，于灌注后 72 h 注射 overexpression or knockdown