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第44卷第9期 刘 玉，应 帅，罗 灿，等. Sublytic C5b⁃9上调KLF5促进Thy⁃1肾炎大鼠肾小球系膜细胞
2024年9月 生成IL⁃23的作用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（9）：1198-1206 ·1201 ·

光素酶报告基因实验测定IL⁃23的启动子活性。即 数±标准误（x ± sx）表示，两两比较采用配对 t 检验，
先在检测管中加入 25 μL 荧光素酶检测试剂Ⅱ，放 组间比较则采用单因素方差分析。应用 GraphPad
入荧光检测仪中，接着转移5 μL 1×PLB裂解的细胞 Prism 软件（版本 5.01）进行统计学分析，P < 0.05 为
液到检测管中，检测萤火虫荧光素酶的活性，最后 差异有统计学意义。
向检测管中加25 μL 1×Stop&Glo 试剂，混匀后再测
®
2 结 果
定海肾荧光素酶的活性。萤火虫荧光值与海肾荧
光值的比值即为最终结果。 2.1 Thy⁃1N大鼠发病不同时间的肾组织中KLF5和
1.2.8 LV⁃shCTR感染GMC IL⁃23蛋白的表达
收集大鼠GMC悬液，接种于96孔板（5×10 个/孔）， SD 大鼠尾静脉注射含 Thy⁃1Ab 的 ATS，复制
3
培养24 h。用MEM培养液将LV⁃shCTR 稀释成3个 Thy⁃1N 大鼠模型，并分别于注射 ATS 后 1、2、3、6、
浓度，即 1×10 、1×10 、1×10 TU/mL。每个培养孔内 12 h 收取大鼠的肾组织，以 0 h 无处理的肾组织作
6
5
7
加100 μL的LV⁃shCTR稀释液，12 h后换液，继续培 对照，WB 实验检测 KLF5 和 IL⁃23蛋白的表达。结
养60 h，置荧光显微镜下观察GFP表达情况，以选取 果发现，两种蛋白的表达在1 h开始上升，2 h时上升
最佳滴度的LV⁃shRNA。 显著，3 h 时 KLF5 的表达呈现高峰，而 IL⁃23 的表达
1.2.9 肾动脉灌注术 则在 6 h 时升到峰值，但在 12 h 时两种蛋白的表达
经腹腔注射3 mg/mL 戊巴比妥钠（1 mg/100 g）， 均已回落（图1）。
麻醉大鼠后，在其剑突下约 0.5 cm 处切开腹部。在
A
腹腔中部找到腹主动脉旁的肾动脉。先后在两侧 0 h 1 h 2 h 3 h 6 h 12 h
KLF5 51 kDa
肾动脉开口的上端和下端用动脉夹夹闭。行头皮
针穿刺并迅速将生理盐水稀释的1 mL病毒悬液（含 IL⁃23 19 kDa
1×10 TU/mL 的 LV⁃shCTR 或 LV⁃shKLF5）推注到肾 β⁃actin 42 kDa
7
动脉内。用纱布按压创口 5 min 使其感染肾脏细
B 4
胞。5 min后松开腹主动脉上的动脉夹，用明胶海绵 KLF5 ** **
IL⁃23
按压止血。最后分层缝合，用碘伏消毒创口 ［9，22］ 。 3 ** ** **
1.2.10 可见光三维成像及冰冻切片检查 Relative protein level 2
为了确认上述肾动脉灌注术的成功率，在肾动
脉灌注的第 72 h 时取大鼠的心、肝、脾、肺和肾 5 种 1
脏器，快速置于小动物活体成像系统（PerkinElmer 0
公司，美国），进行可见光三维成像检查，即通过5种 0 h 1 h 2 h 3 h 6 h 12 h
A：The protein levels of KLF5 and IL⁃23 in the renal tissues of
脏器的荧光强度判定肾动脉灌注LV⁃shCTR 后的器
Thy⁃1N rats at 0，1，2，3，6 and 12 h were examined by WB. B：Semi⁃
官分布。此外，取大鼠肾组织行冰冻切片，再用荧
**
quantitativeanalysisofWB.Comparedwiththe 0hgroup，P < 0.01（n=3）.
光显微镜观察肾组织中GFP的表达与分布。 图1 Thy⁃1N大鼠发病不同时间的肾组织中KLF5和IL⁃23
1.2.11 基因沉默的体内实验 蛋白的表达
取 20只雄性SD大鼠（180~200 g），随机分为4组 Figure 1 The expression levels of KLF5 and IL⁃23 protein
（每组 n=5），即正常血清组（normal serum，NS）组、 in the renal tissues of Thy ⁃ 1N rats at different
time
Thy⁃1N 组 、LV⁃shCTR+Thy⁃1N 组 和 LV⁃shKLF5+
Thy⁃1N组。前两组的处理是：分别给大鼠尾静脉注 2.2 Sublytic C5b⁃9刺激GMC不同时间KLF5和IL⁃23
射正常兔血清或 ATS（剂量均为 0.75 mL/100 g）， 蛋白的表达
后两组的处理是：大鼠行肾动脉灌注术分别导入 予 sublytic C5b⁃9 刺激大鼠 GMC 0、1、2、3、6、
LV⁃shCTR 或 LV⁃shKLF5 72 h 后，再注射 ATS 诱导 12 h，提取GMC蛋白质，WB检测KLF5和IL⁃23两种
Thy⁃1N。当Thy⁃1N大鼠发病6 h时，取其肾组织，用 蛋白的表达。结果显示，sublytic C5b⁃9刺激GMC后
WB检测KLF5和IL⁃23蛋白的表达。 1 h，KLF5和IL⁃23蛋白的表达开始上调，2 h时上升

1.3 统计学方法 明显，并分别在3 h和6 h达到峰值，12 h时两种蛋白
所有实验均独立重复 3 次，所得定量数据以均 的表达已见回落（图2）。