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第45卷第11期 汪佰成，倪晶怡，刘馨月，等. 广谱中和新型冠状病毒及其变体的纳米抗体制备及功能研究［J］.
2025年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（11）：1598-1607 ·1599 ·

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（severe Biotechnology 公司）；博来霉素、TMB 显色终止溶液
®
acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS⁃CoV⁃ （上海 Beyotime公司）；Amicon Ultra⁃4离心过滤装置
2）引起的冠状病毒疾病（coronavirus disease 2019， （Merck公司，德国）；COVID⁃19⁃Spike（XBB1.5）蛋白
COVID⁃19）大流行是过去 20 年来全球第 3 次冠状 假病毒、考马斯亮蓝快速染色溶液和 His 标记蛋
［1］
病毒大流行 。截至 2024 年 12 月，世界范围内报 白琼脂糖高速纯化树脂（上海 Yesen 公司）；DMEM
告的病例累计已超过 7.77 亿，导致全球 700 多万人 培养基、Hoechst 33342 染料、TRIzol（Thermo Fisher
死亡 。这场全球性的卫生危机不但给世界公共 Scientific 公司，美国）；TaKaRa 逆转录试剂盒、Taq
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卫生系统带来了沉重负担，而且严重影响了全球 DNA Polymerase HotStart enzyme、T4 连接酶（北京
［3］
经济 。虽然各大机构迅速开发了许多种有效的 TaKaRa Bio 公司）；限制性内切酶 Spe Ⅰ、Sac Ⅰ
疫苗，但由于接种疫苗引起的免疫反应不断下降以 （NEB 公司，美国）；大肠杆菌 TG1 感受态细胞（深
及新变体的不断出现（Alpha、Beta、Gamma、Delta、 圳 KT HEALTH 公司）；生物膜干涉技术（BLI，Pall
Omicron 等），想要根除 SARS⁃CoV⁃2 仍然具有极大 ForteBio Corp公司，美国）；倒置荧光显微镜（Leica公
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的挑战性 。 司，德国）；咪唑（Biofroxx公司，德国）。
纳米抗体（nanobody，Nb）是在羊驼、骆驼和鲨鱼 1.2 方法
的外周血中产生的独特抗体 ［5-6］ 。它们的大小仅为 1.2.1 噬菌体文库的建立及免疫学筛选
传统 IgG 抗体的 1/10，是能够选择性结合抗原的最 每周对 1 只成年羊驼进行 1 次 WT⁃RBD 皮下注
小功能抗体片段 ［7-8］ 。并且相比传统抗体，Nb 具有 射来触发免疫反应，连续 6 次注射免疫后，通过
诸多优点，比如高亲和力、较高的稳定性和溶解度、 TRIzol 从外周血淋巴细胞中提取总 RNA，使用逆转
快速的组织渗透能力、识别隐藏表位的能力以及生 录试剂盒从总 RNA 中逆转录获得 cDNA。随后，使
［9］
产成本低等 。 用不同模板量的 cDNA，通过 Taq DNA Polymerase
本研究首先使用野生型菌株刺突蛋白的受体 HotStart enzyme 催化进行巢式 PCR 得到 DNA 产物。
结合域（wild type receptor⁃biding domain，WT⁃RBD） 获得足够数量的 DNA 产物后，将 pComb3XSS 噬菌
免疫羊驼，构建出 Nb 噬菌体文库，之后通过 SARS⁃ 体质粒载体和 DNA 产物用限制性内切酶 Spe Ⅰ和
CoV⁃2Dekta 变体RBD 蛋白（Delta⁃RBD）筛选文库得 Sac Ⅰ酶切，然后用T4连接酶连接，即可获得含有目
到 4 种 Nb，这些 Nb 对 SARS⁃CoV⁃2 原始株及 Delta⁃ 的基因的载体质粒。然后用电转移法将载体质粒
RBD、SARS⁃CoV⁃2 XBB 变体 RBD 蛋白（Omicron⁃ 转移到大肠杆菌TG1感受态细胞，建立目标纳米抗
RBD）均具有高亲和力。此外，通过实验证实 Nb45 体的细菌文库。将细菌文库梯度稀释后平板划线，
可以在体外有效中和 Omicron 变体的假病毒，并进 构建的菌库容量由单个菌落的总数决定。随机选
一步证明了这4种Nb具有较高的热稳定性和 pH 稳 取几种单克隆菌落进行菌落 PCR，以评估单克隆抗
定性。这些实验结果均表明，这 4 种Nb 具有防治 体的阳性率。其他文库菌落均储存在-80 ℃冰箱。
由SARS⁃CoV⁃2及其变体引起的COVID⁃19的巨大潜 将筛选抗原 Delta⁃RBD 包被免疫管，4 ℃过夜；
力。此外，本研究中确立和使用的这种构建文库和 PBS 洗管后，室温封闭 2 h；加入制备的噬菌体文库
筛选抗体的策略也可以广泛用于制备广谱中和病 孵育 1 h；PBST（1×PBS 加 0.1% Tween20）洗管后加
毒及其多种变体的Nb。 入 Trypsin 溶液，室温旋转洗脱 30 min；加入 10%
AEBSF 终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的
1 材料和方法
1.5 mL 离心管中，即为第 1 轮筛选出的噬菌体洗脱
1.1 材料 液。将第1轮噬菌体洗脱液浸染感受态细胞TG1，获
293T⁃ACE2 细胞获赠于南京大学的吴稚伟教 得1轮筛选过的噬菌体文库，重复此筛选方法3轮，获

授；10%胎牛血清（上海 ExCell Bio 公司）；100 U/mL 得筛选后的阳性文库。挑选筛选后的文库中的单
青霉素、100 μg/mL链霉素（南京KeyGEN BioTECH公 克隆，进行单克隆ELISA，筛选出数个阳性Nb。为了
司）；WT⁃RBD（上海BIOINTRON 公司）；Delta⁃RBD、 进一步研究，对这些Nb 进行测序，然后通过GENtle
Omicron⁃RBD 和小鼠单克隆抗myc 标签抗体（HRP） 软件进行分析并翻译成氨基酸，根据互补决定区 3
（北京Sino Biological 公司）；氨苄青霉素（ampicillin， （complementarity determining region 3，CDR3）的序列
Amp）、单组分显色液（TMB）和 IPTG（北京 Solarbio 不同分为不同家族。