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第45卷第11期
               ·1600 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年11月


              1.2.2 Nb的表达和纯化                                    病毒在 37 ℃下混合 1 h。孵育完成后，将混合物加
                  从 TG1 细胞中提取克隆质粒，电转移到巴氏酵                       入到293T⁃ACE2细胞中，孵育24 h后切换成新鲜培
              母菌X⁃33。将酵母菌在含有100 μg/mL博来霉素的                      养基。然后用Hoechst 33342染料对细胞进行染色，
              酵母蛋白胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dex⁃            观察细胞核，然后通过倒置荧光显微镜观察不同实
              trose medium，YPD）中培养，然后挑取单克隆菌落，                   验组的荧光信号。
              接种于含有100 μg/mL博来霉素的扩大培养基中，扩                       1.2.6 AlphaFold2建模和分子对接
              大培养后诱导表达，对菌液离心留取上清液。使用含                                通 过 AlphaFold2.ipynb（https：//colab.research.
              有His标签的蛋白琼脂糖高速纯化树脂与上清液中                           google.com/）在线模拟生成 WT⁃RBD、Delta⁃RBD、
              的目的蛋白结合，分别用5 mmol/L咪唑、10 mmol/L咪                  Omicron⁃RBD 和 4 种 Nb 的三维结构。随后将 4 种
              唑溶液脱杂蛋白 2 遍，最终用 500 mmol/L 咪唑洗                    Nb通过ZDOCK（https：//zdock.umassmed.edu/）分别在
              脱。纯化目的蛋白后通过琼脂糖凝胶电泳纯度分                             线对接到不同的RBD上，每个结合均给出了前10名
              析，并通过Amicon Ultra⁃4离心过滤装置浓缩。                      预测结果。选取预测结果第1名作为后续实验对象，
                              ®
              1.2.3 亲和力实验                                       通 过 DrugScore PPI（https：//cpclab.uni ⁃ duesseldorf.
                  通过 ELISA 测定 4 种 Nb 与 WT⁃RBD 蛋白及其              de/），预测它们的结合位点，将 ddGcalc>3 Kcal/mol

              变体的结合活性。WT⁃RBD、Delta⁃RBD 或Omicron⁃                或ddGcalc 最高的位点作为预测的结合位点。最后
              RBD 溶解于 pH 为 9.6 的 CBS 溶液（1.59 g Na2CO3与          通过 Pymol 软件进行结构修饰，得到分子对接结果
              2.94 g NaHCO3加蒸馏水定容至1 000 mL）中（1 μg/mL）           及结合位点。
              加置高结合力96孔酶板上（每孔100 μL），4 ℃冰箱过                     1.2.7 热稳定性和pH稳定性的评价
              夜后 PBST 洗板，随后 3% BSA 室温下封闭 1 h 再次                      为了探究 Nb 的理化性质，使用不同条件处理
              洗板，每孔加入含有 Nb 的 3% BSA 室温下孵育 2 h                   Nb后进行ELISA实验。在探究热稳定性实验中，将
              后洗板5次，随后加入抗myc标签抗体（HRP）室温孵                        Nb 在不同温度［室温（room temperature，RT）、40 ℃、
              育1 h再次洗板，随后加入TMB单组分显色溶液，避                         60 ℃、80 ℃、90 ℃、95 ℃］孵育 10 min；95 ℃孵育不
              光显色，显色结束后加入TMB显色终止液（450 nm，                       同时间（0、10 min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、18 h、
              不含硫酸）终止显色反应，用酶标仪读取 450 nm 处                       24 h）；37 ℃孵育不同时间（0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、
              的吸光度值。本研究还进一步通过使用不同浓度                             7 d、8 d、9 d、10 d），通过ELISA实验测定处理后的Nb
              RBD 与几种Nb 结合显色后的吸光度值计算得到了                         与抗原的结合能力。
              各个抗体的半数效应浓度（EC50）。                                     为了探究pH稳定性，将4个Nb在不同的pH值
              1.2.4  生 物 膜 干 涉 技 术（bio ⁃ layer inteferometry，  （3、5、7、9、11）下溶解于 3%的 BSA 中，并在室温下
              BLI）实验检测Nb对Omicorn⁃RBD的亲和力                        孵育2 h。同样通过ELISA实验测定处理后的Nb与
                  通过BLI分析Nb对Omicorn⁃RBD的亲和力。首                   抗原的结合能力。
              先，将 Omicron⁃RBD 稀释至 1 μg/mL 后装入 APS 生             1.3  统计学方法
              物传感器中 10 min，调整 3 种 Nb 浓度为 1 μmol/L 进                  通过 GraphPad Prism 软件进行统计分析，实验
              行预实验。确定每个Nb的最大可用浓度后，在不同                           均重复 3 次，计量资料以均值±标准差（x ± s）表示，
              Nb 浓度的基础上设置 6 个实验组：最大浓度，稀释                        两组间比较用 t 检验，多组间比较使用单因素方差
              2 倍、4倍、8倍、16倍和空白对照。检测缓冲液为添                        分析，P <0.05为差异有统计学意义。
              加 0.1% BSA 和 0.02% Tween 的 PBS。通过 600 s 的
                                                                2  结 果
              结合，以及随后的300 s解离，测定出几种Nb与RBD
              蛋白的结合能力。采用八元系统数据分析软件对                             2.1  靶向WT⁃RBD Nb文库的构建
              原始数据进行拟合，最终确定拟合常数（R ）和平衡                               为了获得靶向WT⁃RBD的Nb，本研究构建了一
                                                    2
              解离常数（KD）。                                         个大型且高度多样化的文库。首先，用WT⁃RBD 蛋
              1.2.5 假病毒中和试验                                     白免疫羊驼 6 次，之后从外周血淋巴细胞中提取总
                  为感染 COVID⁃19⁃Spike（XBB1.5）蛋白假病毒，              RNA（图 1A），通过 cDNA 制备、VHH 基因扩增构建
              将 293T⁃ACE2 细胞接种到 96 孔细胞培养板中。随                    细菌文库（图 1B、C）。后续测得细菌文库容量为
              后将不同浓度的 Nb45（50、100 和 200 μmol/L）与假               9.6×10 pfu，同时通过随机选取 48 个单克隆菌落进
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