Page 71 - 南京医科大学自然版

第45卷第11期 汪佰成，倪晶怡，刘馨月，等. 广谱中和新型冠状病毒及其变体的纳米抗体制备及功能研究［J］.
2025年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（11）：1598-1607 ·1601 ·

行 PCR 分析，结果显示细菌文库阳性率为 95.83% 列。通过Clustal Omega对48个序列进行系统发育树
（图1D）。随后通过细菌文库及辅助噬菌体初步构建 分析（图2B），此举为筛选中和Nb提供了更多选择和
出噬菌体文库，效价为1.64×10 pfu/mL。这些结果 潜在的候选对象。由于互补决定区3（complementarity
12
表明，本研究建立了一个靶向WT⁃RBD的Nb文库。 determining region 3，CDR3）序 列 的 多 样 性 ，选 择
2.2 利用Delta⁃RBD筛选Nb Nb34、Nb42、Nb45和Nb48作为Delta⁃RBD 的结合抗
使用Delta⁃RBD 对噬菌体文库进行免疫管筛选 体进行进一步研究。
和单菌落 ELISA 从而筛选出靶向 Delta⁃RBD 的 Nb。 2.3 Nb的表达、纯化和鉴定
经过3轮富集，噬菌体文库逐渐扩增200倍。随后，通 考虑到将来的应用范围、生产成本和大规模生
过2轮ELISA从192个随机克隆中选择出125个结合 产可能性，选择毕赤酵母系统进行表达。用Ni⁃NTA
率>3的阳性克隆（图2A）。对所有阳性克隆菌落进行 蛋白琼脂糖高速纯化树脂纯化诱导表达出的 Nb。
测序并进行比对，去除重复序列，得到48个不同的序 SDS⁃PAGE 分析显示，纯化的 Nb34、Nb42、Nb45 和

A M RNA B Oligo dT primer Random 6⁃mer
M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 （μL）

（bp）
2 000—
（bp）
2 000— ←28S 1 000— —900 bp
1 000— ←18S 750— —600 bp
750— 500—
500— 250—
250— ←5S
100— 100—

C Oligo dT primer Random 6⁃mer
（bp） M 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 M 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 （μL）
2 000—
1 000—
750—
500—
—400 bp
200—
100—

D
（bp） M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
2 000—
1 000—
500— —400 bp
200—
100—

（bp）
2 000—
1 000—
500—
200— —400 bp
100—

（bp）
2 000—
1 000—
500—
200— —400 bp
100—
A：The electrophoresis results verified the quality and purity of the total RNA. B：In the first round of PCR amplification，gel electrophoresis
showed clear bands of cDNA templates amplified by two primers. C：In the second round of PCR amplification，gel electrophoresis was performed using
different amounts of cDNA templates. D：Among the 48 screened clones，the positive rate was 95.83%. M：marker.
图1 建库过程中部分凝胶电泳结果图
Figure 1 Results of partial agarose gel electrophoresis during library building