Page 9 - 南京医科大学自然版
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第45卷第11期         戴欣媛，夏    天，朱 磊，等. RNA结合蛋白RBMS3通过稳定p21 mRNA抑制乳腺癌增殖［J］.
                 2025年11月                  南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（11）：1537-1545，1571                   ·1539 ·


                CACCTCTGCTGACTCCA⁃3′；p21 正向 5′⁃TGTCCGT⁃           站（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（gene on⁃
                CAGAACCCATGC⁃3′、反向 5′⁃AAAGTCGAAGTTC⁃              tology，GO）功 能 富 集 分 析 ；利 用 TIMER 数 据 库
                CATCGCTC⁃3′。相对定量采用2         -ΔΔCt  或2 -ΔCt 法计算。  （Tumor Immune Estimation Resource，https：//cistrome.
                1.2.3 蛋白质印迹（Western blot，WB）实验                    shinyapps.io/timer/）分析 RBMS3 与 p21 的相关性。
                     用 RIPA 裂解液提取蛋白质，经 SDS⁃PAGE 分                1.2.9  免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）
                离后，转印至PVDF膜。膜用5%牛血清白蛋白封闭                          染色与分析
                2 h，4 ℃孵育一抗（β⁃actin，1∶1 000；RBMS3，1∶                  取皮下移植瘤组织，10%福尔马林固定后石蜡
                1 000；p21，1∶1 000）过夜。PVDF 膜清洗 3 次后，室              包埋；切片脱蜡、水化后，柠檬酸盐修复液抗原修
                温孵育二抗（1∶5 000）2 h，最后用化学发光显色系                      复，过氧化物酶阻断剂孵育15 min，PBS冲洗3次；滴
                统检测。                                              加一抗（RBMS3、p21 及 Ki67，稀释比例均为 1∶200）
                1.2.4 集落形成实验                                      4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗 3 次后，滴加二抗 HRP 标记
                    将500个乳腺癌细胞接种于6孔板中，培养2周                        的抗兔 IgG，室温孵育 30 min；DAB 显色 1 min，苏木
                后，用 PBS 洗涤 2 次，75%乙醇固定 1 min，结晶紫染                 精复染细胞核30 s，脱水封片后显微镜观察拍照。
                色15 min，晾干后观察。                                    1.2.10 放线菌素D（actinomycin D，Act D）实验

                1.2.5  5⁃乙炔基⁃2’⁃脱氧尿苷（5⁃ethynyl⁃2’⁃deoxy⁃              将RBMS3过表达、敲降及对照细胞接种于6孔
                uridine，EdU）掺入实验                                  板，培养过夜后，用5 μg/mL Act D处理0、2、4、6、8 h；
                    将细胞1×10 个/孔接种于96孔板，培养24 h后，                   提取 RNA，通过 qRT⁃PCR 检测 p21 表达水平，分析
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                用10 μmol/L EdU 37 ℃处理2 h；细胞经4%多聚甲醛                mRNA的稳定性。
                固定、0.3% Triton X⁃100透化10 min后，与click addi⁃        1.2.11  RNA 免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，
                tive solution 孵育 30 min；最后用 1×DAPI 染色细胞           RIP）实验
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                核。通过荧光显微镜观察红色（EdU）与蓝色（DA⁃                             用1 mL RIPA裂解液裂解2×10 个细胞，与5 μg
                PI）信号，分析细胞增殖情况。                                   抗 RBMS3 抗体或 IgG 4 ℃孵育过夜；用 Protein A/G
                1.2.6 体内异种移植瘤模型                                   磁珠沉淀 RNA⁃蛋白质免疫复合物，纯化 RNA 后定
                    动物实验经南京医科大学动物保护与使用委员                          量靶mRNA水平。
                会批准（批准号：IACUC⁃2201030）。将12只4~6周龄                  1.2.12 双荧光素酶报告基因实验
                雌性 BALB/C 裸鼠随机均分为 2 组（SUM⁃1315⁃NC                     在乳腺癌细胞中，共转染300 ng pGL3报告质粒
                组、SUM⁃1315⁃RBMS3 组），每组 6 只；将 1×10 个稳             ［含 p21 3′非翻译区（3′⁃untraslated region，3′⁃UTR）
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                定过表达 RBMS3 或对照的 SUM⁃1315 细胞，注射至                   或p21 AU富集元件（AU⁃rich elements，ARE）突变区
                小鼠乳腺脂肪垫，观察肿瘤生长情况。细胞注射后                            域，突变型将AUUUA基序突变为AGGGA］与5 ng海
                第21天，对所有小鼠实施安乐死，剥离肿瘤组织，称                          肾荧光素酶内参载体；转染48 h后，参照双荧光素酶
                量肿瘤质量并行后续检测。                                      报告基因试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。
                1.2.7 流式细胞术                                       1.3  统计学方法
                    细胞周期分析：收集转染后的乳腺癌细胞，离                              数据用均数±标准差（x ± s）表示，采用线性回归
                心后用PBS洗涤，75%冰冷乙醇固定过夜；再次离心                         分析 RBMS3 与 p21 的相关性；组间比较用GraphPad
                去除上清，PBS 洗涤 2 次，碘化丙啶染色 30 min（避                   Prism 7.0软件进行双尾Student’s t检验。P < 0.05为

                光），采用流式细胞仪，选择FL2⁃APC⁃A通道收集PI                      差异有统计学意义。
                荧光信号。
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                    细胞凋亡分析：收集转染后的乳腺癌细胞，离
                心后用 PBS 洗涤，1×Binding buffer 重悬细胞，加入               2.1  RBMS3抑制乳腺癌细胞增殖
                5 μL Annexin V⁃APC和5 μL 7⁃AAD染色液，避光后上                 集落形成实验显示：RBMS3 过表达显著抑制
                机检测早期与晚期凋亡细胞比例，计算总凋亡率。                            SUM⁃1315和MDA⁃MB⁃231细胞的集落形成能力（图
                1.2.8 生物信息学分析                                     1A、B），而RBMS3敲降则显著促进集落形成（图1C、
                    基于前期RNA测序数据          ［11］ ，筛选差异表达基因           D）。EdU掺入实验结果与之一致，RBMS3过表达组
               （标准：|log2 （fold change）|>1且P < 0.05），通过在线网         EdU阳性细胞率显著低于对照组（图1E、F），RBMS3
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