Page 87 - 南京医科大学自然版

第45卷第12期 石 靓，奚佩雯，吴 靓，等. RBM7在乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231中的表达及其对AKAP12表达
2025年12月 的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（12）：1766-1774 ·1769 ·

过夜，PBS 缓冲液冲洗 3 次，加兔二抗，室温下孵育 变量均采用均数±标准差（x ± s）的形式进行描述性统
20~30 min，PBS 冲洗 3 次。二氨基联苯胺（diamino⁃ 计，以准确反映数据的集中趋势和变异程度。对于符
benzidine，DAB）显色后充分冲洗，苏强度评分和阳 合正态分布且方差齐性的两组均数比较使用两组独
性细胞比例评分之积。着色强度评分标准：0 分未 立样本t检验；使用方差分析比较多组间均数差异。
染色，1分浅棕色，2分棕色，3分深棕色。阳性细胞 实验均重复3次，P < 0.05为差异有统计学意义。
比例评分标准：0 分无阳性细胞，1 分阳性细胞比例
2 结 果
≤10%，2 分阳性细胞比例 11%~50%，3 分阳性细胞
比例51%~80%，4分阳性细胞比例为81%~100%。 2.1 在乳腺癌细胞 MDA⁃MB⁃231 中构建稳定的
1.2.6 转录组分析 RBM7过表达及干扰细胞株

利用 Illumina Hiseq 4000 平台进行转录组 RNA 通过qRT⁃PCR和Western blot实验发现，在过表
测序，通过Tophat2工具soft（v2.1.0）将读数与参考基 达 RBM7 的实验组（RBM7）和对照组（NC）中，与对

因组作图。由 DESeq（1.10.1）发现的调整后的 P < 照组相比，实验组 RBM7 的 mRNA 和蛋白表达水平
0.05 的基因（log2FC>2）被指定为差异表达。使用 R 明 显 增 高 ，差 异 有 统 计 学 意 义（P 均 < 0.05，图
包 clusterProfiler 实现对差异表达基因（differentially 1A~C）；同时，在干扰RBM7的实验组（Sh⁃1和Sh⁃2）
expressed gene，DEG）在特定基因本体论（gene ontol⁃ 和对照组（SCR）中，实验组 RBM7 的 RNA 和蛋白表
ogy，GO）富集显著性的量化评估。 达水平明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05，图

1.2.7 RNA结合蛋白免疫共沉淀（RNA binding pro⁃ 1D~F），筛选出的稳转细胞株用于后续实验。
tein immunoprecipitation，RIP） 2.2 高通量测序检测发现RBM7主要富集通路
将人乳腺癌细胞 MDA⁃MB⁃231（2×10 个）用 本课题组前期研究将已构建的RBM7过表达组
7
RNA免疫沉淀裂解缓冲液裂解，离心取上清，在4 ℃ （RBM7）和相应对照组（NC）的乳腺癌细胞提取
下分别与 5 μg 抗兔 RBM7 抗体和抗兔非特异性 IgG RNA 并进行 RNA⁃seq 检测，发现可能受 RBM7 表达
摇床孵育过夜。待抗体与RNA以及磁珠结合后，对 改变影响的基因和通路 。进一步经GO分析发现，
［7］
沉淀下来的复合物进行RNA纯化。之后，将纯化的 受RBM7影响的显著表达的基因主要富集在细胞周
RNA进行qRT⁃PCR、RT⁃PCR及琼脂糖电泳实验。 期这一通路中（图2A）。因此，猜想受RBM7影响的
1.3 统计学方法 显著差异表达的基因可能在细胞周期过程中发挥
应用GraphPad Prism 10统计软件分析，所有数值 重要作用。

A 20 * B MDA⁃MB⁃231 C 8 *
Relative expression mRNA of RBM7 15 β⁃actin -31 kDa Relative expression protein of RBM7 6 4
NC
RBM7
RBM7
10
-43 kDa

0 5 2 0
NC RBM7 NC RBM7
D * E F
1.5 * SCR Sh⁃1 Sh⁃2 1.5 * *
MDA⁃MB⁃231
Relative expression mRNA of RBM7 1.0 β⁃actin -31 kDa Relative expression protein of RBM7 1.0
RBM7

0.5
0.5
-43 kDa
0.0 0.0
SCR Sh⁃1 Sh⁃2 SCR Sh⁃1 Sh⁃2
*
A：The overexpression of RBM7 regulated RNA expression of RBM7 in breast cancer cell MDA⁃MB⁃231 via qRT⁃PCR（n=3，P < 0.05）. B，C：The
*
overexpression of RBM7 regulated protein expression of RBM7 in breast cancer cell MDA⁃MB⁃231 via Western blot（n=3，P < 0.05）. D：The knock⁃
*
down of RBM7 regulated RNA expression of RBM7 in breast cancer cell MDA⁃MB⁃231 via qRT⁃PCR（n=3，P < 0.05）. E，F：The knockdown of RBM7
*
regulated protein expression of RBM7 in breast cancer cell MDA⁃MB⁃231 via Western blot（n=3，P < 0.05）.
图1 人乳腺癌 MDA⁃MB⁃231 细胞中 RBM7 过表达效率及干扰效率的验证
Figure 1 The validation of RBM7 overexpression and knockdown in breast cancer cell MDA⁃MB⁃231