Page 86 - 南京医科大学自然版
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第45卷第12期
·1768 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2025年12月
库，美国），由江苏省人民医院龙江院区中心实验室 2 -ΔΔCt 值为 RBM7 和 AKAP12 基因的相对表达量。内
保存。胰蛋白酶消化液（上海 Beyotime 公司）； 参 β⁃actin 下游引物序列：5′⁃TCACCCACACTGT⁃
DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovin serum，FBS）（上 GCCCATCTACGA⁃3′，上游引物序列：5′⁃CAGCG⁃
海Wisent公司）；慢病毒及相关转染试剂（上海吉玛 GAACCGCTCATTGCCAATGG⁃3′；RBM7下游引物序
制药技术有限公司）；RNA Trizol、PrimeScript RT 列：5′⁃CAGAGACAAGCAGTGATGAACAG⁃3′，上游
Reagent试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂（TaKaRa公 引物序列：5′⁃ TTGATCCAGAGGTGAAGAACCAA⁃
司，日本）；兔抗人β⁃actin多克隆抗体、兔抗人RBM7多 3′；AKAP12 下游引物序列：5′⁃TGTCAAGCCGAAA⁃
克隆抗体（21896⁃1⁃AP）、兔抗人AKAP12多克隆抗体 CCTTAGC⁃3′，上游引物序列：5′⁃GTACCAGATGC⁃
（25199⁃1⁃AP）（武汉Proteintech公司）；增强型化学发 GACCTCATT⁃3′。
光试剂（ECL）蛋白印迹底物（南京诺唯赞生物科技股 1.2.4 Western blot检测蛋白表达
份有限公司）；青霉素⁃链霉素⁃两性霉素B混合溶液 按照蛋白提取试剂盒说明书要求提取待测细
（北京兰杰柯科技有限公司）；polybrene（上海吉玛制 胞的总蛋白，根据上清液体积向 EP 管内加入适量
药技术公司）；RIP试剂盒（Millipore公司，美国）。 SDS蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴煮8 min，冷切后放
1.2 方法 置-20 ℃冰箱保存。根据 SDS⁃PAGE 凝胶配制试剂
1.2.1 细胞培养与转染 盒说明书制作 SDS⁃PAGE 凝胶，4 ℃湿润保存。蛋
MDA⁃MB⁃231 细胞株培养于含 10%FBS、1%青 白样品加至 SDS⁃PAGE 凝胶，设置电源参数为恒压
霉素⁃链霉素⁃两性霉素 B 混合溶液的 DMEM 培养 80 V电泳2 h，后根据目的蛋白分子大小切割条带，设
液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中，当细胞生长至对 置电源参数为恒定250 mA冰浴下转膜至PVDF上，
数生长期，融合至70%左右时，用胰酶消化细胞，每 摇床快速封液室温封闭 2 min，分别与一抗 RBM7
孔2×10 个细胞铺入6孔板中，待细胞贴壁24 h后进 （1∶1 000）、AKAP12（1∶1 000）和β⁃actin（1∶2 000）在
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行转染，参照慢病毒转染试剂说明书分别设过表达 4 ℃摇床内孵育过夜，TBST 清洗 3 次，每次 10 min，
RBM7的实验组（RBM7）和对照组（NC），干扰RBM7 兔二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST清洗3次，每次
的实验组（Sh⁃1 和 Sh⁃2）和对照组（SCR），每孔分别 10 min。滴加 ECL 化学发光液于暗室中显影、曝
加入对应体积的慢病毒和2 μL polybrene，混匀后将 光。使用Image J软件进行定量分析。
6孔板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。 1.2.5 免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测
1.2.2 筛选细胞株 人乳腺癌组织中RBM7和AKAP12蛋白的表达
本研究设计的 RBM7 慢病毒载体携带嘌呤霉 本研究使用的所有乳腺癌组织均来自2020年南
素抗性基因，乳腺癌细胞 MDA⁃MB⁃231 感染慢病毒 京医科大学第一附属医院乳腺中心收治的乳腺癌
48 h后换为含1 μg/μL嘌呤霉素的完全培养基开始 患者 24 例，年龄 33~80 岁，平均 49.45 岁。纳入标
筛选，嘌呤霉素浓度逐步加至5 μg/mL，通过荧光显 准：①经穿刺活检或手术病理检查证实为乳腺癌；
微镜观察其绿色 GFP 荧光情况，只有转染并整合 ②既往无乳腺癌病史及其他严重基础疾病；③患者
RBM7 慢病毒的细胞能表达嘌呤霉素抗性蛋白，可 及患者家属能够理解研究流程，自愿加入本研究，
在含嘌呤霉素的培养基中存活，经这种方法可以逐 签署知情同意书，依从性好，配合随访。排除标准：
步淘汰未成功感染RBM7慢病毒的细胞，2周后获得 ①男性乳腺癌、炎性乳腺癌，妊娠期或哺乳期乳腺
稳定表达的抗性克隆细胞株并保种、传代。 癌；②临床资料不完善；③合并其他恶性肿瘤或近
1.2.3 qRT⁃PCR检测mRNA表达 5 年内曾患除乳腺癌之外的恶性肿瘤；④合并非恶
取对数生长期的细胞，按 Trizol 试剂说明书提 性肿瘤的严重疾病，影响患者的依从性或使患者处
取总 RNA，Prime Script RT Master Mix Perfect Real 于危险状态；⑤痴呆、智力异常或任何妨碍对知情
time 合成 cDNA（37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃延伸）。 同意书理解的精神疾病。本研究中乳腺癌标本的获
使用SYBR Premix Ex TaqTM 试剂，反应体系20 μL， 取和使用均经过南京医科大学第一附属医院伦理委
SYBR 10 μL，前后引物 10 μmol/L 各 0.8 μL，cDNA 员会批准（2025⁃SR⁃790）。取手术切除的乳腺癌组织
2 μL，灭菌蒸馏水6 μL，ROX 0.4 μL。反应条件：预 标本（直径为0.5 cm左右的组织块），以4%甲醛溶液
变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，共40个 固定 24 h，石蜡包埋后切片。成 片 后 分 别 滴 加
循环，Step One PlusTM Real⁃time PCR System。计算 RBM7（1∶200）和 AKAP12 抗体（1∶200），4 ℃孵育
