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第45卷第2期         王嘉慧，李璐琪，张 悦，等. 膜联蛋白ANXA5调节黑色素瘤细胞铁死亡及其机制研究［J］.
                  2025年2月                     南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（2）：157-164                        ·159 ·


                同剂量给药组等，每组3个复孔。给药后不同时间点                           60 min，PBS冲洗，接着一抗孵育（anti⁃ANXA5）4 ℃过
                吸取各组培养孔中的细胞培养上清液，参照LDH试剂                          夜；次日PBS冲洗充分后，滴加100 μL二抗溶液室温
                盒说明书与对应试剂混匀，室温放置 5 min，酶标仪测                       下孵育 40 min，接着 PBS 冲洗 3 次，除去 PBS 后滴加
                定，记录各样品在450 nm处吸光度值进行统计分析。                        50 μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3~5 min，
                    收集细胞，超声破碎细胞后，离心获取细胞裂                          显色后经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固拍照。
                解上清液，采用 TBA 法进行 MDA 检测，在上清液中                      1.2.10  Western blot
                加 入 底 物 显 色 ，在 532 nm 有 最 大 吸 收 峰 ，利用                 提取细胞的总蛋白，用 10% SDS⁃PAGE 胶进行
                532 nm 与 600 nm 下的吸光度差值计算过氧化脂质                    蛋白分离，并转移到 PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉溶液
                MDA 的含量。采用DTNB法检测GSH，参照GSH测                       封闭1 h，加入相应一抗溶液4 ℃孵育过夜。次日使
                定试剂盒说明书，加入各试剂，混匀静置 5 min，在                        用 PBST 洗涤膜3次，室温孵育二抗1 h，PBST清洗膜
                405 nm 酶标仪测定各孔吸光度值，总谷胱甘肽                          3次，最后对膜进行曝光成像，Image J软件定量分析。

               （GSSG+GSH）量为黄色的TNB形成量。再采用GSH                       1.3  统计学方法
                清除试剂处理样本测定 GSSG 的含量，GSH 含量即                           运用 Graphpad Prism 8 统计软件对数据进行统
                为总谷胱甘肽（GSSG+GSH）的量扣除GSSG的含量。                      计分析，不同组间的差异比较使用 Student’s t 检验

                1.2.6  脂质过氧化的检测                                   或单因素方差分析，两组以上的多组间比较采用
                    C11⁃BODIPY 581/591 是一种脂质过氧化的荧                 ANOVA 单因素方差分析。每组实验均重复 3 次，
                光探针，对氧自由基敏感。目标细胞经给药处理建                            P < 0.05为差异有统计学意义。
                立铁死亡细胞模型后，加入适当C11⁃BODIPY 581/591                  2 结    果
               （终浓度为 5 μmol/L），孵育 1 h。然后用 PBS 洗涤
                细胞 2 次，用胰酶消化制备细胞悬液进行流式细胞                          2.1  ANXA5在黑色素瘤组织中表达水平升高
                检测。采用 FL1、FL2 通道分别检测对应信号，C11⁃                         根 据 The Human Protein Atlas（HPA）数 据 库
                BODIPY 581/591 在细胞膜内与活性氧发生氧化还                    （https：//www.proteinatlas.org）分析显示，在人体正常
                原反应，与脂质活性氧的产生成正比，测定FL1荧光                          组织中，ANXA5 mRNA在皮肤组织中表达水平较低
                信号以可视化监测细胞脂质过氧化程度。                               （图1A）；TCGA数据库分析显示，在人体各癌变组织
                                  2+
                1.2.7  亚铁离子（Fe ）的检测                               中，ANXA5 mRNA 在黑色素瘤中显著高表达（图
                    使用高细胞渗透性的荧光探针 FerroOrange 检                   1B）。进一步通过 GEPIA2 对比皮肤黑色素瘤（skin
                测胞内 Fe 水平。将待测定细胞吸去培养基，用无                          cutaneous melanoma，SKCM）与正常皮肤组织的转录
                         2+
                血清 DMEM清洗3次，然后加入适量浓度为1 mmol/L                     数据，发现ANXA5 mRNA在SKCM中的表达水平较
                的 FerroOrange 工作液，37 ℃避光孵育 30 min，再滴              癌旁正常组织显著升高（图1C，P < 0.05）。此外，来
                加 DAPI 进行复染 2 min，取出细胞爬片置于载玻片                     自Protein Atlas蛋白水平的数据显示，在各肿瘤患者
                上，进行荧光倒置显微镜观察、拍照。                                 中，约90%患者黑色素瘤组织检测到ANXA5蛋白的
                1.2.8  RT⁃qPCR                                    高表达（图 1D）。免疫组化染色分析人黑色素瘤组
                    根据 RNA 提取试剂盒说明书提取各组细胞总                        织芯片（MEL961）中 ANXA5 蛋白的表达水平，结果
                RNA，逆转录成 cDNA 后进行 qPCR，引物序列分别                     显示与痣相比，原发性黑色素瘤中ANXA5蛋白染色

                为 ：mouse Ascl4 ⁃ F：5′ ⁃ CTCACCATTATATTGCT⁃        程度加深，且在转移性黑色素瘤中显著升高（图 1E、
                GCCTGT；Ascl4 ⁃ R：5′ ⁃ TCTCTTTGCCATAGC⁃            F，P < 0.01），提示ANXA5表达可能与黑色素瘤发生
                GTTTTT；mouse β⁃actin⁃F：5′⁃GGCTGTATTCCCCTC⁃        发展呈正相关。
                CATCG；mouse β⁃actin⁃R：5′⁃CCAGTTGGTAACAAT⁃         2.2  敲除ANXA5增强黑色素瘤对铁死亡的易感性
                GCCATGT。采用2     -ΔΔct 方法进行数据分析，比较各组                   为探究 ANXA5 高表达是否影响黑色素瘤对铁
                间基因表达情况。                                          死亡的敏感性，以黑色素瘤细胞株B16F10为研究对

                1.2.9  免疫组化染色                                     象，借助CRISPR⁃CAS9技术构建ANXA5敲除细胞株
                    石 蜡 切 片 脱 蜡 和 水 化 后 用 PBS 冲 洗 ，采 用           （ANXA5⁃KO）（图2A），在此基础上采用铁死亡诱导
                10 mmol/L Tris，pH10.0，95 ℃加热12 min缓慢冷却至           剂 RSL3 或 Erastin 建立黑色素瘤细胞铁死亡模型。
                室温进行抗原修复，然后滴加免疫染色封闭液，封闭                           与野生型（wild type，WT）B16F10细胞相比，随着铁死
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