Page 18 - 南京医科大学自然版
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第45卷第2期
               ·158 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年2月


              靶点和新策略是临床研究的重要课题。铁死亡是                             Lipofectin 3000（Invitrogen 公司，美国）；DMEM 培养
              铁依赖性的、细胞内脂质过氧化引起的细胞死亡，                            基和胎牛血清（HyClone 公司，美国）；嘌呤霉素（pu⁃
              作为一种程序性细胞死亡的新形式，不仅可以抑制肿                           romycin，MCE 公司，美国）；总 RNA 提取试剂盒（南
              瘤生长，在增强免疫治疗反应和克服癌症治疗耐药性                           京诺唯赞公司）。
              上具有巨大潜力，已成为癌症治疗研究的热点                      ［1-2］ 。  1.2  方法
              最新研究表明，对传统治疗有抵抗力或有高转移倾向                           1.2.1  细胞培养
              的癌症类型可能对铁死亡易感，尤其是恶性黑色素瘤                                黑色素瘤细胞株 B16F10、B16F1 均使用含有
              具有较高 RAS 基因突变率，铁死亡诱导剂 RSL3 和                      10%胎牛血清的 DMEM 培养基，置于 37 ℃、5% CO2
              Erastin 对 RAS 突变的黑色素瘤细胞具有选择致死                     培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行后续实验。
                                                      ［3］
              活性，铁死亡效应与肿瘤治疗疗效密切相关 。因                            1.2.2  细胞转染
              此，探讨黑色素瘤细胞对铁死亡的防御机制，增强                                 细胞铺板后，待细胞汇合度为 70%~80%时，按
              黑色素瘤细胞对铁死亡的易感性，将为靶向铁死亡                            照 Lipofectin3000 说明书进行质粒或 siRNA 片段转
              治疗黑色素瘤提供可能的潜在靶点。                                  染，转染 6~8 h 后换成含 10%胎牛血清的 DMEM 培
                  膜联蛋白 A5（annexin A5，ANXA5）是一种钙离                养基继续培养24~48 h，然后收集细胞，采用总RNA
              子依赖性的磷脂结合蛋白，能特异、高效地结合磷                            提取试剂盒和RIPA裂解液分别提取细胞总RNA和
              脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），具有抗凝血、               总蛋白进行后续实验。
              抗炎症，抗肿瘤等活性，并广泛应用于细胞凋亡检                            1.2.3 ANXA5基因的敲除及敲减
              测和体内分子影像技术           ［4-7］ 。近年来，多项研究表明                 在黑色素瘤细胞 B16F10 中采用 CRISPR⁃Cas9
              ANXA5在多种类型的肿瘤中异常表达，成为预测肿                          技术敲除 ANXA5 基因，根据 Mus musculus ANXA5
              瘤发展的生物标志物，如结肠癌、肝癌、肾癌、乳腺                          （cDNA clone MGC：5730 IMAGE：3488901）设计gRNA
                                                    ［8］
              癌等，在临床上对诊断、预后具有重要价值 。然而                           5′ ⁃ caccgcacgactctacgatgcctac ⁃ 3′ ，靶 向 ANXA CDS
              ANXA5 在黑色素瘤中的表达及其生物学分子机制                         （coding sequence）序列在第256~275位置。将gRNA
              并不清楚。本研究探讨了 ANXA5 在黑色素瘤中的                         退火产物与 LentiCRISPR v2 酶切载体混合 16 ℃酶
              表达及其对铁死亡效应的影响，初步揭示其可能的                            连过夜，连接产物转化感受态细胞，涂板后挑取单克
              调控机制，以期为黑色素瘤治疗提供新的潜在靶                             隆菌落进行基因测序。构建好的质粒转染 B16F10
              点，增强黑色素瘤的铁死亡易感性。                                  细胞构建敲除株，采用筛选压力 2 μg/mL puromycin
                                                                进行培养，最后采用梯度稀释接种 96 孔板筛选
              1 材料和方法
                                                                ANXA5⁃KO单克隆敲除细胞株。
              1.1  材料                                                采用 RNAi 技术敲低 ANXA5，合成靶向 human
                  小鼠黑色素瘤细胞株 B16F10、B16F1 和人源黑                   ANXA5 的 siRNAs 序列为：5′⁃AACTACTCCTTGCT⁃
              色素瘤细胞 A375 由本实验室保存。黑色素瘤组织                         GTTGTGA⁃3′（siANXA5#1）和5′⁃AAGCCTGGAAGAT⁃
              芯片编号 MEL961（上海威奥生物科技有限公司）；                        GACGTGGT⁃3′（siANXA5#2），通过脂质体 lipo3000
              gRNA以及qPCR引物（南京金斯瑞生物科技股份有                         转染A375细胞株，Western blot验证siRNA敲减效果。
              限公司）；抗体 ANXA5（#8555，CST 公司，美国）；酰                  1.2.4  CCK⁃8检测

                                                                                          4
              基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4（acyl⁃CoA synthe⁃                     将细胞浓度调整为1×10 个/mL，每孔100 μL接
              tase long⁃chain family member 4，ACSL4）（ab155282，  种 96 孔板，每组设置 3 个复孔，每孔再补 100 μL 培
              Abcam公司，英国）；β⁃actin（武汉塞维尔生物科技公                    养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养；质粒或

              司）；CCK⁃8 检测试剂盒、还原性谷胱甘肽（glutathi⁃                  siRNA 转染24~48 h后每孔加入10 μL CCK⁃8溶液，
              one，GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）检测试剂盒、                      设置培养液的空白孔作为对照组，37 ℃孵育 2 h 后
              脂质氧化丙二醛（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒、                  在酶标仪上检测各组在450 nm吸光度值，记录每组
              乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、              不同复孔的数据进行统计分析。

              RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；Fer⁃                       1.2.5 LDH、GSH和MDA含量检测
                                                                                          5
              roOrange（DOJINDO 公司，日本）；C11⁃BODIPY（Cay⁃                将细胞浓度调整为1×10 个/mL，每孔500 μL接
              man公司，美国）；RSL3、Erastin（Selleck公司，美国）；             种24孔板铺板。次日，根据实验设计分成对照组，不
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