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第45卷第2期 王嘉慧，李璐琪，张 悦，等. 膜联蛋白ANXA5调节黑色素瘤细胞铁死亡及其机制研究［J］.
2025年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（2）：157-164 ·161 ·

显示：ANXA5⁃KO 细胞呈更明显的氧化应激状态， 显著升高（图 2H，P < 0.05）。这些结果表明敲除
即GSH/GSSG比例下降（图2G，P < 0.05），MDA含量 ANXA5能增强黑色素瘤细胞对铁死亡的易感性。

A B WT ANXA5⁃KO C
1.5 WT
** ANXA5⁃KO
** （%） 120
B16F10 ANXA5⁃KO mn） 1.0 **
（450 0.5 *
60
ANXA5 35 kDa Cell viabllity 90
β⁃actin 42 kDa D 30 **
0
0
0 1 2 4
1 2 3 4 1 2 3 4 RSL3（μmol/L）
RSL3（μmol/L）
D E Control Erastin RSL3
WT
（%） 120 ANXA5⁃KO WT
90
Cell viabllity 60 ** 100 μm

30
0
0 5 10 20 ANXA5⁃KO
Erastin（μmol/L）
100 μm
F 15 ** *** G 20 * H （%） 250 * *
Relative fluorescene intensity 10 5 GSH/GSSG 15 5 * Relative MDA 150
200

10
100
50
0
0
WT ANXA5⁃ WT ANXA5⁃
ANXA5⁃KO
WT
KO
KO KO 0 WT ANXA5⁃ WT ANXA5⁃
KO
Control Erastin RSL3 RSL3： - - + + RSL3： - - + +
A：ANXA5 knockout validated in B16F10 cells by Western blot. B：Assays for LDH release induced by RSL3. C：CCK⁃8 assays for B16F10 cells
2+
treated by RSL3. D：CCK⁃8 assays for B16F10 cells treated by Erastin. E，F：Fluorescence detection of Fe by FerroOrange staining in red（scale bar=100 μm）.
G：The changes of GSH/GSSG ratio induced by RSL3 treatment. H：Intracellular lipid peroxidation detected by MDA assays. Compared with the WT
*
**
group. P < 0.05，P < 0.01，and *** P < 0.001（n=3）.
图2 敲除ANXA5增强RSL3或Erastin诱导黑色素瘤细胞铁死亡效应
Figure 2 Knockout of ANXA5 promoted susceptibility of ferroptosis induced by RSL3 or Erastin in melanoma cells
2.3 ANXA5负调节铁死亡蛋白ASCL4的表达 胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化是有别于其
为探究 ANXA5 参与黑色素瘤细胞铁死亡防御 他程序性死亡的生化特征，采用 C11⁃BODIPY 染色

的可能机制，对WT和ANXA5⁃KO细胞进行了RNA⁃ 进行流式检测，ANXA5⁃KO细胞膜脂质过氧化程度
seq 分析，结果表明敲除 ANXA5 能显著影响黑色素 显 著 增 加（图 3E）。 当 ANXA5⁃KO 细 胞 中 回 补
瘤细胞的基因表达谱（图 3A）。ACSL4 是调节脂质 ANXA5 表达时，ANXA5 能明显抑制黑色素瘤细胞
组成的关键酶，能促进铁死亡的发生，决定了细胞 的铁死亡效应，表现出对铁死亡诱导剂的抵抗性
［9］
对铁死亡的敏感性 。通过火山图显示差异性表达 （图 3F），此时 ACSL4 蛋白水平随着 ANXA5 表达增
基因，相比WT组，ANXA5⁃KO细胞中Acsl4 mRNA上 加而显著下降，Western 结果显示 ANXA5 能负调节

调 2.278 倍（图 3B）。通过 RT⁃qPCR 和 Western blot ACSL4 蛋白水平（图 3G、H）。由此可见，ANXA5 调
进一步验证，敲除 ANXA5 后，Acsl4 mRNA 和 ACSL4 控 ACSL4 表达可能是其参与黑色素瘤细胞铁死亡
蛋白水平均显著上升（图3C、D）。铁死亡过程中，细 调节的作用机制之一。