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第45卷第4期             陈贝宁，杨清湖，袁增强，等. 亨廷顿舞蹈症中星形胶质细胞转录异质性分析［J］.
                  2025年4月                    南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（4）：487-497，587                     ·489 ·


                C6H5Na3O7·2H2O（北京国药公司）；蔗糖（上海沪试公                   图；STRING 数据库进行PPI分析。将测序结果使用
                司）；异丙醇、乙醇（北京京试公司）；三氯甲烷（北京                         基于负二项分布的 P 值计算模型进行 P 值计算，以
                通广公司）；耐高温全预混第一链cDNA合成试剂盒                          P < 0.05、|log2 （fold change）|>1作为阈值标准筛选显著
               （北京 Transgen 公司）；SYBR Green（Gentex 公司，美            差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）。
                国）；星形胶质细胞 ACSA⁃2 磁珠、成年鼠脑解离试                       1.2.4 取材及切片制备
                剂盒（Miltenyi公司，德国）；基因扩增仪（杭州博日公                         小鼠麻醉后，灌流取脑，置于 4%多聚甲醛中室
                              TM
                司）；QuantStudlo 3 Real⁃Time PCR Instrument、Orbi⁃   温固定过夜，30%蔗糖脱水。利用冰冻切片机将鼠
                trap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪（Thermo Fisher 公     脑切为30 μm厚度的薄片，置于脑片防冻液（含30%
                                    TM
                司，美国）；gentleMACS Octo Dissociator with Heat⁃      乙二醇、30%蔗糖的PBS溶液）中，-20 ℃保存。
                ers（Miltenyi 公司，德国）；Agilent 2100 bioanalyzer      1.2.5 免疫荧光染色
               （Agilent公司，美国）。                                        脑片取出后用 PBS 清洗，加抗原修复液（含

                1.2  方法                                           50 mmol/L 柠檬酸钠，0.05%Tween20 的 PBS 溶液），
                1.2.1 分选星形胶质细胞                                    95 ℃ 加 热 20 min，晾 至 室 温 ，用 PBST（ 含 0.1%
                    用2%三溴乙醇按20 μL/g浓度麻醉小鼠，经心脏灌                    Triton X⁃100 的 PBS 溶液）清洗 3 次（5 min/次），室
                                                                       TM
                注预冷生理盐水，灌注至肝脏发白后分离小鼠大                             温封闭1 h（含5%BSA、2%马血清的PBST溶液）。一
                脑。分离出的大脑立即转移到含有成年鼠脑解离试                            抗4 ℃摇床过夜。次日将脑片取出，恢复至室温后，
                剂盒酶消化试剂的组织解离C管中，并剪成小块。用                           PBS 清洗 3 次，二抗室温 1 h，PBS 清洗 3 次，取出贴
                全自动组织解离器将鼠脑充分磨碎，经70 μm滤网过                         片，抗荧光淬灭剂封片。采用激光共聚焦成像，通
                滤、去髓鞘后获得细胞悬液。所得细胞悬液用星形                            过Image J测量胞体面积，并利用Neuroanatomy 插件
                胶质细胞ACSA⁃2磁珠孵育，经MS柱分选。磁珠与                         分析星形胶质细胞轴突长度。
                星形胶质细胞表面抗原（astrocyte cell surface antigen         1.2.6 RNA提取
                ⁃2，ACSA⁃2）结合，ACSA⁃2阳性细胞吸附在磁极上，                        组织样本用液氮速冻后加入TRIzol匀浆，加入1/5
                ACSA⁃2 阴性细胞无磁性，分别收集 ACSA⁃2 阳性和                    TRIzol 体 积 的 三 氯 甲 烷 ，上 下 颠 倒 混 匀 ，离 心
                阴性细胞，300 g 离心 10 min 得到细胞沉淀，弃上清                  （14 000 g、15 min、4 ℃）；取上清加入等体积异丙醇，
                后液氮速冻细胞。                                          上下颠倒混匀，离心（14 000 g、15 min、4 ℃）；75%酒
                1.2.2 转录组学测序                                      精清洗2次，晾干后加水溶解，得到RNA溶液。
                    星形胶质细胞样品由深圳微科盟科技集团有                           1.2.7 实时荧光定量PCR
                限公司进行 RNA 提取、文库构建和测序。利用                               逆转录 RNA 得到 cDNA，RT⁃qPCR 为 20 μL 体
                TRIzol 法提取 RNA，NanoPhotometer spectrophotome⁃     系：10 μL 2×SYBR Green，1 μL cDNA，1 μL上、下游
                ter检测RNA 纯度，Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA         引物（10 μmol/L），8 μL ddH2O；程序：95 ℃ 10 min；
                                                     TM
                                               ®
                完整性。利用 Illumina 的 NEBNext Ultra RNA Li⁃           95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环；95 °C 15 s，
                brary Prep Kit 构建文库并进行库检。库检合格后，                   60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s；以β⁃actin 为内参基因，采用
                进行Illumina测序。                                     2 - ΔΔCT 方法对目的基因进行相对定量。引物序列见
                1.2.3 数据处理和生物信息学分析                                表1。
                    使用 Illumina Novaseq 6000 测序平台对文库进             1.3  统计学方法
                行测序，获得待测片段的序列信息。利用Fastp软件                             所有统计学结果均采用 GraphPad Prism 9 进行
                对原始数据进行质控并过滤，去除低质量及冗余序                            分析及绘图，所有数据均以均数±标准差（x ± s）表
                列。使用HISAT2 v2.0.5 构建参考基因组的索引，并                    示，两组资料间比较采用独立样本 t 检验，P < 0.05
                使用 HISAT2 v2.0.5 将配对末端 clean reads 与参照            为差异有统计学意义。
                基因组比对。利用R4.4.1及Rstudio软件处理数据并
                                                                  2  结 果
                绘图；DESeq2包对原始Counts表达矩阵进行标准化
                处理及差异分析，获取上下调基因信息；org.Mm.eg.db                    2.1 HD小鼠病程发展过程中星形胶质细胞的变化
                包进行基因注释；Cluster Profiler和enrich plot包进行               为明确星形胶质细胞是否与 HD 病程相关联，
                基因本体论（Gene Ontology，GO）；ggplot2 包进行绘              检测了不同月龄HD模型小鼠脑内星形胶质细胞的
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