Page 89 - 南京医科大学自然版
P. 89

第45卷第4期         秦 浩，谢卫国，陈小红，等. 基于16S核糖体RNA高通量测序前瞻性分析50岁及以上重度
                  2025年4月         烧伤患者早期肠道菌群变化［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（4）：523-534                   ·525 ·


                吸烟、饮酒等，每日可正常排成形粪便 1~2 次；②近                        分析效应大小（linear discriminant analysis effect size，
                2 个月内无抗生素服用史；③无合并严重心、肺、肝、                         LEfSe）研究两组菌群从门到属水平的变化，具体步
                肾及神经系统疾病，无合并消化道肿瘤、严重糖尿                            骤为：首先采用非参数 Kruskal⁃Wallis 秩和检验检
                病、严重高血压、自身免疫性疾病；④精神状态正                            测两分组间丰度差异显著的物种；再利用成组的
                常，同意且能够自主配合本项目。                                   Wilcoxon秩和检验检查显著差异物种在亚组之间是
                    本研究为前瞻性观察性研究，经武汉市第三医                          否都趋于同一分类；最后用 LEfSe 分析对数据进行
                院生物医学研究伦理委员会批准（批号：武三医伦                            降维和评估差异显著物种的影响力，即 LDA 评分。
                KY2024⁃009），实验对象均签署知情同意书。                         挖掘二者之间具有统计学差异的生物标志。⑧通

                1.2  方法                                           过 PICRUSt2 软件预测菌群的功能丰度。⑨使用
                1.2.1  高通量16S rRNA基因测序分析                          R 语言中的igraph包对试验样本属水平差异菌行相
                    将冷冻粪便样本通过粪便采集管送至武汉美                           关性可视化分析。
                益添生物医药有限公司进行高通量 16S rRNA 基                        1.3  统计学方法
                因测序分析。主要步骤为①粪便样本总 DNA 的                               应用 SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析。计
                提取与质检：包括样本均质、菌体收集和保存、细胞                           量资料中符合正态分布的数据用均数±标准差
                裂解、DNA 提取与沉淀收集，最后进行 DNA 质检。                      （x ± s）表示，组间比较采用独立样本 t 检验；不

                ②PCR扩增及产物纯化：采用16S rRNA基因V3~V4                     符 合 正 态 分 布 的 数 据 采 用 中 位 数（四 分 位 数）
                区域的通用引物，341F（5′⁃CCTACGGGNGGCWG⁃                  ［M（P25，P75）］表示，组间比较采用 Wilcoxon 秩和
                CAG⁃3′）与805R（5′⁃GACTACHVGGGTATCTAATCC⁃            检验，定性资料、无序分类资料采用卡方检验，有
                3′），所有引物均含有特定的条码序列。③文库构                           序分类资料使用 Kruskal⁃Wallis 检验。P < 0.05 为
                建：对扩增好的 PCR 产物进行混样建库，加上测序                         差异有统计学意义。
                接头，进行PCR扩增后用磁珠分选去掉引物二聚体
                                                                  2 结    果
                等小片段，并记录文库 index 信息。④上机测序：文
                库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的                            2.1  Burn组和Control组基本资料比较
                需求将不同文库进行pooling后上机测序，扩增子测                            分析比较两组样本的年龄、性别、身高、体重、体
                序平台为Illumina MiSeq，测序策略为PE250。                    重指数（body mass index，BMI）等，结果提示差异均无
                1.2.2  菌群结构、功能预测及差异菌相关性分析                         统计学意义（P > 0.05，表1）。
                    ①使用 R 语言的 dada2 软件包去除错误序列，                                  表1  研究对象基本资料
                即去噪（denoise），将质量检查的序列聚类为扩增子                          Table 1 Basic information of experimental subjects
                序列变体（amplicon sequence variant，ASV）。②通               Variable   Burn（n=13） Control（n=12） t/χ 2  P
                过 QIIME（v1.9.1）软件进行样本菌群操作分类单元                     Age（years，x ± s）  65 ± 8    60 ± 7   1.161 0.120
               （operational taxonomic unit，OTU）数目分析。③使用           Sex［n（%）］                            0.987 0.320
                Rarefy 方法标准化样本序列，将样本序列与Silva 数                      Male         8（61.5）      5（41.7）
                据库（release 138，SSURef_NR99）进行序列比对，确                 Female       5（38.5）      7（58.3）
                定样本中每条序列的分类等级（界、门、纲、目、科、                          Weight（kg，x ± s） 062.23 ± 10.35 064.58 ± 12.45 0.515 0.611
                属、种），记录各样本的菌群分类信息，分析各类菌                           Height（cm，x ± s） 162.92 ± 10.14 166.75 ± 8.750 1.015 0.321
                                                                         2
                                                                  BMI（kg/m ，x ± s） 23.41 ± 3.04  23.04 ± 2.97  0.312 0.758
                属在样本中的相对丰度。④使用标准的 Z⁃score 对
                两组存在的差异菌相对丰度进行标准化，构建差异                            2.2  Burn组和Control组粪便菌群OTU数目
                菌的菌群热图。Z⁃score=（相对标准丰度-平均值）/                          25例样本共获得4 630 409条序列，使用R语言
                标准差，其中，Z⁃score将相对丰度进行标准化，缩小                       的 dada2 软件包去除错误序列（denoise）后筛得
                数量级，可避免因数值过大或过小造成数据偏差。                            4 063 918条有效高质量序列，共获得2 091条OTU，
                ⑤通过 QIIME（v1.9.1）计算样本菌群 Alpha 多样性                 测序覆盖度达99.0%以上，测序深度足够，可以覆盖
                指数，包括丰度指数（Chao1 指数和 Ace 指数）、多样                    样本的绝大部分微生物。韦恩图可直观展示各组
                性指数（Shannon 指数）。⑥基于样本菌群的相对丰                       样本的物种分布情况，如图 1 所示。两组样本共有
                度，行样本菌群Beta多样性分析。⑦利用线性判别                          的 OTU 数目为502 个 ，占总数的24.0%。其中Burn
   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94