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第45卷第5期 王静晓，朱国庆. 非囊泡性细胞外纳米颗粒——重要的细胞间通讯形式［J］.
2025年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（5）：683-690，726 ·685 ·

胞对 EV 的摄取速度较快，而对 EM 和 SM 的摄取速 外环境中能维持其正常形态，故可用 AFM 鉴定
［3］
度较慢 。 NVEP ［13］ 。AFM的优势在于能够直接观测物质的分
子与原子结构，而无需对样品进行特殊处理，但成
2 NVEP的分离与鉴定
［16］
像速度相对较慢，对操作技巧及探针要求较高 。
NVEP的分离及鉴定是研究其生物学功能及潜 TEM鉴定：TEM分析细胞超微结构及各类生物
在应用的关键环节。在实际应用中，可根据具体情 样品的分辨率高达0.1~0.2 nm ［17］ 。TEM被广泛应用
况选择合适的技术或多种技术组合，以获得高质量 于观察 EV 的形态和直径大小 ［18］ ，也可以用于观察
［3］
的NVEP样品。 EM 和 SM 的形态和直径大小 。然而，TEM 内部的
2.1 分离技术 不利条件，如电子轰击引起的损伤和结构水的真空
分离 EM 和 SM 的方法主要有差速离心法和非 蒸发，可能会影响所观察颗粒的形态和大小，并需
对称场流分离（asymmetric field⁃flow fractionation， 要将样本稀释到适当浓度，避免堆叠，以确保观察
AF4）法。 结果的准确性。
差速离心法：基本原理是利用离心速度的差异 NTA：NTA是一种基于光学原理的测量技术，主
来分离大小不同的颗粒。该方法通过 300g 离心 要用于测定悬浮液中纳米颗粒的粒径分布、浓度和
15 min 去除细胞，上清液通过 10 000g 离心 1 h 去除 运动状态。该技术利用光散射和布朗运动的特性，
细胞碎片，将上清液通过 0.22 μm 的过滤器过滤后 通过激光束照射纳米颗粒，使其产生散射光，然后
经 167 000g 离心 4 h 获得 EV。将上清液继续以 通过光电转换器和信号处理系统分析颗粒的尺寸、
167 000g 离心 16 h 后获得 EM，再将上清液继续以 浓度和运动状态等信息 ［19-20］ 。需注意的是，SM的尺
［3，9］
367 000g 离心 16 h 获得 SM 。该方法操作简便， 寸有可能小于NTA能够可靠检测的范围，在后续分
［9］
能够一次性处理大量样本，是目前最常用的分离 析中对颗粒数量的归一化处理应谨慎进行 。
EV、EM和SM的方法，缺点是耗时较长。 特定蛋白标志物分析：EV的特异性蛋白标志物
AF4法：AF4分离装置通常为高度在50~500 μm 已经明确，四跨膜蛋白家族中的CD9、CD63和CD81
之间的扁平细通道。通过产生抛物状层流，将样品 以及肿瘤易感基因101重组蛋白（recombinant tumor
从入口向前输送到出口。AF4 技术具有可调节的 susceptibility gene 101，TSG101）作为EV的蛋白标志
横流，使其在分离不同大小样品时具有很高的灵活 物 ［21］ ，钙联蛋白作为EV的阴性标志物 ［22］ 。在NVEP
性 ［4］ 。AF4 分离方法的优势在于操作方便、快速 中未发现这些 EV 的蛋白标志物 ，因此在鉴定 EM
［3］
（< 1 h）和高重复性，并能以高分辨率（1 nm）分离纳 或SM时首先需要检测EV的蛋白标志物，以排除样
米颗粒 ［13］ 。不足之处在于投入量和产量有限，难以 本中含有 EV 的可能性。Zhang 等 发现，人结肠直
［3］
获得足量的EM或SM以满足实验需求，且这项分离 肠癌细胞 DiFi 的 EM 有 synteninm⁃1 蛋白而 SM 中没
技术依赖专门仪器。由于 AF4 分离装置的负载能 有 synteninm⁃1 蛋白，EM 中热休克蛋白 70 家族成员
力有限，通常需要在分离之前先进行超速离心浓缩 13（heat shock protein 70 kDa family member 13，HS⁃
样本 。 PA13）、TGFBI、烯醇化酶α（α⁃enolase，ENO1）和烯醇
［14］
2.2 鉴定方法 化酶γ（γ⁃enolase，ENO2）蛋白水平很低而SM中这些
鉴定 EM 和 SM 的方法主要包括原子力显微镜 蛋白较多。本实验室发现，这些区分EM和SM的标
（atomicforce microscopy，AFM）、透 射 电 子 显 微 镜 志物并不一定适合于其他细胞，因此在鉴定某种细
（transmission electron microscope，TEM）、纳米粒子 胞的EM和SM时，需寻找和发现可以区分EM和SM
跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）和特 的标志物。另外，在鉴定 EM 或 SM 时，还要同时以
定蛋白标志物分析。 全细胞裂解液作为对照，以排除样本中其他细胞成
AFM 鉴定：基本工作原理是利用探针与样品 分 的 干 扰 。 由 于 EM 和 SM 是 近 年 来 新 发 现 的
表面原子间的微弱作用力，采用扫描探针技术，在 NVEP，尚未确定可适合于多种细胞产生的NVEP的
微观尺度上对样本的电磁、物理或分子特性进行研 特异蛋白标志物，需进一步探索。
究 ［15］ ，可用于探讨 NVEP 的生物力学特性、大小、结
3 NVEP的生物学功能与意义
构和功能之间的相关性 ［16］ 。EV、EM 和 SM 在生物
力学特性、直径大小和结构上存在差异，且在细胞 EM或SM是新发现的细胞间通讯方式，可以调