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第45卷第6期
               ·788 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年6月


              1.1.3 仪器                                          MAD）>3］。MAD 是一种用于衡量数据集离散程度
                  流式细胞仪（赛默飞公司，美国）；37 ℃恒温培                       的统计量，可以衡量观测值相对于数据集的中位数
              养箱（上海一恒有限公司）；倒置显微镜（奥林巴斯                           的平均偏离程度。对于质控后的数据集，使用
              公司，日本）；PCR仪器（赛默飞公司，美国）；荧光显                        ScaleData 函数进行归一化，并选择前 2 000 个基因
              微镜（徕卡公司，德国）。                                      进行PCA，将集成数据集进一步简化为二维空间。
              1.1.4 细胞与试剂                                       1.2.4 聚类分析与细胞注释
                  BASE⁃2B 细胞系购自美国典型培养物收藏中                            根据 PCA 的结果，选出前 20 个主成分进行
              心（ATCC）；10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素溶液、                      UMAP（uniform manifold approximation and projec⁃
              高糖 DMEM 培养基（赛默飞世尔科技公司，美国）；                        tion）聚类分析（resolution=0.1）。利用 IntegrateData
              Annexin V⁃APC/DAPI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒                   软件包   ［23］ 合并样本的单细胞表达矩阵。在细胞聚

             （武汉普诺赛生命科技有限公司）；Mini⁃PROTEAN                  ®    类后，利用 singleR 进行单细胞注释，判定对应细胞
                  TM
              TGX 预制蛋白质凝胶（伯乐公司，美国）；抗 ZBP1                       类型。对筛选出的细胞进行DEG分析，DEG筛选的
             （1∶1 000）、抗 Caspase⁃3（1∶1 000）、抗 GSDMD             标准同上。使用 Clusterprofiler 软件包对 DEG 进行
             （1∶1 000）、抗MLKL（1∶2 000）；抗β⁃actin（1∶1 000）、二       GO功能注释和KEGG通路富集分析。
              抗（1∶2 000）；（Abcam 公司，美国）；荧光染料的抗                   1.2.5 COPD小鼠模型的构建
              体 EpCAM⁃APC（BD公司，美国）。                                  选取 C57BL/6J 小鼠于实验第 1、14、28 和 42 天
              1.2 方法                                            给予气管内脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）5 mg/kg
              1.2.1 Bulk RNA⁃seq数据分析                            注射。给药后将小鼠直立并旋转 10~20 s 以确保
                  使用 R 软件包     ［19］ 对 GSE124180 数据集中 21 例       LPS 均匀分布。随后小鼠在密室中接受被动烟雾暴
              人源肺组织样本（其中 6 例 COPD 患者肺组织样本                       露（总悬浮颗粒为300 mg/m ）30 min，2次/d，持续2个
                                                                                        3
              和 15 例非 COPD 患者肺组织样本）的 Bulk RNA⁃seq               月。建模成功后左肺叶取样 2 份，1 份用于 Western
              数据进行表达分析，获取与 COPD 发生相关的细胞                         blot检测，1份在10%甲醛中固定24 h，然后脱水、石
              组成与基因表达变化。利用 R 软件包读入上述                            蜡包埋和HE染色。使用数字病理扫描仪进行观察。
                                                                                              OE⁃MTRNR2L1 细胞
              Bulk RNA⁃seq 数据。利用主成分分析（principal                 1.2.6 细胞培养及构建BASE⁃2B
              component analysis，PCA）进行样本层面质控。利用                     BASE⁃2B 细胞和 BASE⁃2B      OE ⁃ MTRNR2L1  细胞在含
              Cluster profiler 包对基因 ID 进行转换，使用 DESeq2           10%胎牛血清和1%青霉素⁃链霉素溶液的DMEM培
              进行 DEG 分析，差异基因筛选标准为 P < 0.05 且                    养基中，于 37 ℃、5% CO2 和 95%湿度的条件下培
              |log2 （fold change）|>1.5。对筛选出的 DEG 进行基            养。当细胞达到约 90%的融合度时进行传代。利
              因本体数据库（gene ontology，GO）功能注释及京                    用携带 MTRNR2L1 的 pcDNA3.1 质粒转染 BASE⁃2B
              都 基 因 组 百 科 全 书（Kyoto Encyclopedia of Genes       细胞。通过碱性裂解法提取pcDNA3.1质粒，并使用
              and Genomes，KEGG）通路富集分析 。                         Nanodrop 评估其浓度后，于-20 ℃保存。将 293T 细
                                             ［20］
              1.2.2 去卷积分析                                       胞按每孔1×10 个细胞的比例铺入6孔板中，于37 ℃
                                                                             6
                  根据每个样本的基因表达谱和去卷积法，使用                          下培养24 h。在导入质粒与pSPAX2和pMD2G包装
              MCPcounter 软件包   ［21］ 获得样本中的细胞组成，进行               因子、氯化钙和BES缓冲盐溶液前1 h更换培养基，
              去卷积分析，推断 Bulk RNA⁃seq 数据队列中的细胞                    培养12 h后再次更换培养基，24 h后收集上清液，经
              组成和表达。                                            2 000 r/min 离心 10 min，用0.45 μm滤膜过滤病毒上
              1.2.3 scRNA⁃seq数据分析                               清液，等量分装后于-80 ℃保存。将5×10 个细胞/孔
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                  在 GSE173896 数据集中获取 3 例 COPD 患者                的BASE⁃2B细胞接种到6孔板中，培养24 h后进行感
             （GSM5282537、GSM5282538、GSM5282539）和3例对             染。将先前制备的病毒在37 ℃水浴中解冻，与聚凝胺
              照组（GSM5282546、GSM5282547、GSM5282548）单            （2 μg/mL）混合后加入细胞中。感染后在第1、3和5天更
              细胞数据样本，从单细胞水平探索与COPD发生相关                          换含有嘌呤霉素（1 μg/mL）的培养基。感染后的BASE⁃
              的分子机制。利用 Seurat 软件包          ［19］ 分析 scRNA⁃seq    2B细胞过表达MTRNR2L1即BASE⁃2B          OE⁃MTRNR2L1 。
              数据，采用 scater 方法    ［22］ 过滤各数据中基因表达异               1.2.7 流式细胞术检测
              常值［中位数绝对偏差（median absolute deviation，                  采用 Annexin V⁃APC/DAPI 荧光双染细胞凋亡
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